التصوير الفلوري متعدد الخلية أحادي الخلية لتصور الأحماض النووية الفيروسية والبروتينات ومراقبة فيروس نقص المناعة البشرية و HTLV و HBV و HCV وفيروس زيكا وعدوى الأنفلونزا
أكتوبر 29, 2020
يظهر هنا بروتوكول لنهج التصوير الفلوري ، multiplex immunofluorescent cell-based detection of DNA ، RNA ، و protein (MICDDRP) ، وهي طريقة قادرة على التصور المتزامن لخلية واحدة من البروتين الفيروسي والأحماض النووية من أنواع مختلفة وتقطعت بهم السبل. يمكن تطبيق هذا النهج على مجموعة متنوعة من الأنظمة.
طريقة الكشف عن الخلايا المناعية الفلورية المتعددة للحمض النووي والحمض النووي الريبي والبروتين من تصور البروتينات والأحماض النووية من أنواع مختلفة وتقطعت بهم السبل داخل الخلايا المفردة في وقت واحد. قبل البذر ، احتضان الغطاء ينزلق في الإيثانول لمدة خمس دقائق ، تليها غسلتان لمدة دقيقتين في PBS. بعد الغسيل الثاني ، غمر زلة الغطاء بالكامل في 20 ميكروغراما لكل مليلتر من بولي دي ليسين لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
في نهاية الحضانة ، قم بإزالة محلول المصفوفة الزائد بغسلتين في PBS وقم بتخفيف الخلايا ذات الأهمية عند 1 × 10 إلى الخلايا السادسة لكل 50 ميكرولتر من PBS لكل تركيز زلة غطاء. ثم قم بزرع 50 ميكرولترا من الخلايا ذات الأهمية على كل زلة غطاء مطلية ب poly-D-lysine لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة ، اغسل الخلايا ثلاث مرات في PBS قبل تثبيتها في 4٪ بارافورمالدهيد لمدة 30 دقيقة.
في نهاية الحضانة ، اغسل الخلايا مرتين في PBS قبل تغلغل الخلايا ب 500 ميكرولتر من 0.1٪ توين 20 في PBS لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة ، اغسل كل زلة غطاء مرتين باستخدام 500 ميكرولتر من PBS الطازج لكل غسلة. لتثبيت زلة الغطاء على شريحة زجاجية ، ضع قطرة صغيرة من طلاء الأظافر الشفاف على شريحة زجاجية معقمة وضع حافة واحدة من الجانب الخالي من الخلايا من زلة الغطاء على قطرة طلاء الأظافر وقم بخفض زلة الغطاء على جانب الخلية المنزلقة المتجهة لأعلى.
أضف بضع قطرات من PBS إلى زلة الغطاء المجمدة لمنع الخلايا من الجفاف واستخدم قلم حاجز كاره للماء لرسم دائرة حول الجزء الخارجي من زلة الغطاء. عندما يتم رسم الحاجز ، استبدل PBS ب 100 ميكرولتر من البروتياز III وضع الشريحة في حاضنة 40 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. في نهاية الحضانة ، اغسل الشرائح مرتين في PBS طازج لمدة دقيقتين لكل غسلة مع الهزاز.
بعد الغسيل الثاني ، قم بتخفيف المسبار محل الاهتمام في 200 ميكرولتر من مخزن التهجين عند 67 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. في نهاية الحضانة ، أضف 50 ميكرولترا من محلول المسبار إلى كل زلة غطاء وضع الشرائح في فرن مرطب 40 درجة مئوية لمدة ساعتين. في نهاية الحضانة ، اغسل الشرائح مرتين باستخدام مخزن غسيل طازج وهزاز لمدة دقيقتين لكل غسلة.
بعد الغسيل الثاني ، انقر فوق الشرائح لإزالة المخزن المؤقت الزائد ومعالجة زلات الغطاء بالتتابع بقطرة واحدة من مكبرات الصوت لقنوات الفلورسنت 1 و 2 و 3 لمدة 30 دقيقة و 40 درجة مئوية لكل مضخم مع غسلتين لمدة دقيقتين في مخزن مؤقت للغسيل الطازج مع تأرجح لكل غسلة بين العلاجات. بعد الغسيل الأخير ، أضف قطرة من مضخم القناة الفلورية 4 إلى زلة الغطاء لمدة 15 دقيقة في فرن 40 درجة مئوية واغسل الشريحة مرتين باستخدام مخزن الغسيل ومرة واحدة باستخدام PBS كما هو موضح. للتلوين المناعي للبروتينات ذات الأهمية ، بعد الغسيل الأخير ، عالج كل زلة غطاء ب 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للحضانة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
في نهاية الحضانة ، قم بصب المخزن المؤقت المانع وأضف 200 ميكرولتر من الجسم المضاد الأساسي ذي الأهمية المخفف في PBS بالإضافة إلى Tween 20 مكملا ب 1٪ ألبومين مصل البقر. بعد حضانة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة ، اغسل الشرائح بغسلتين لمدة 10 دقائق في PBS الطازج بالإضافة إلى Tween 20 مع الرج في كل غسلة قبل وضع ملصقات على العينات بجسم مضاد ثانوي مناسب لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة ، اغسل الشرائح مرتين باستخدام PBS plus Tween 20 لمدة 10 دقائق مع رجها في كل غسلة.
بعد الغسيل الثاني ، قم بتغطية النوى بصبغة نووية مناسبة لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة ، متبوعة بغسلتين في PBS لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة مع الرج. لتركيب العينات للتصوير ، ضع قطرة واحدة من المحلول المضاد للبهتان على شريحة زجاجية معقمة جديدة لكل عينة وانشر المحلول لتغطية مساحة بحجم زلات الغطاء تقريبا. افصل زلات الغطاء عن شرائحها واغمر زلات الغطاء في PBS.
استخدم الملقط لإزالة أي طلاء أظافر متبقي وجفف الجزء الخلفي من زلة الغطاء بمنديل معملي. ثم ضع برفق كل جانب من عينة الغطاء لأسفل على المحلول المضاد للبهتان واترك العينات تجف طوال الليل. كدليل على مفهوم هذا الإجراء ، تم تصنيف الحمض النووي لفيروس نقص المناعة البشرية -1 والحمض النووي الريبي والبروتين وتصورهما في وقت واحد مجهريا على مستوى الخلية الواحدة.
في هذا المثال ، يمكن تصور جينومين من الحمض النووي لفيروس نقص المناعة البشرية -1 داخل خلية واحدة أثناء نسخ الحمض النووي الريبي الفيروسي بنشاط. تم تصدير الحمض النووي الريبي الفيروسي من خلال مركب المسام النووية وتم تصنيع البروتين الفيروسي في السيتوبلازم. كما لوحظ ، لوحظ القليل جدا من التفاعل المتبادل بين مجموعات المسبار عبر الفيروسين ، على الرغم من وضع العلامات بفيروسين قهقريين مع إمكانية التفاعل المتبادل للمسبار.
بالإضافة إلى ذلك ، يمكن القضاء على تلطيخ الحمض النووي الريبي الفيروسي إذا عولجت الخلايا ب RNase أثناء تحضير العينة. يمكن بعد ذلك تحديد متوسط شدة التألق المتكاملة لإشارة الجسم المضاد لكل خلية في كل صورة. كما لوحظ ، تزداد كمية الحمض النووي الريبي قبل الجينومي لفيروس التهاب الكبد B وإجمالي الحمض النووي الريبي HBV على مدار الإصابة بفيروس التهاب الكبد Bv.
يمكن أيضا إجراء تصوير عدوى فيروس التهاب الكبد C عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر باستخدام هدف الغمر بالزيت 60X للكشف عن الفلوروفورات ذات الأهمية. يسمح هذا النهج المحدد للغاية أيضا بتتبع العمليات الفيروسية أو الخلوية بدقة زمنية مكانية عالية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام هذه التقنية لدراسة فيروسات متعددة ومسببات الأمراض الأخرى.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تقدم هذه الدراسة طريقة كشف متعدد البؤر فلوري مناعي قائم على الخلايا لتصوير الحمض النووي، والحمض النووي الريبي، والبروتينات داخل الخلايا المفردة في وقت واحد. يوضح النهج فعاليته في ملاحظة البروتينات الفيروسية والأحماض النووية من أنواع واتجاهات مختلفة، مما يبيّن قابليته الواسعة للاستخدام عبر النظم البيولوجية المختلفة.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال البحث
- بيولوجيا الخلية
- تقنيات الفلورة المناعية
- كشف الفيروسات
الخلفية
- الكشف المتزامن عن عدة جزيئات حيوية أمر حاسم في فهم العمليات الخلوية.
- قد تواجه الطرق التقليدية صعوبات في الخصوصية والتفاعل المتقاطع في الأنظمة المتعددة.
- التطورات في تقنيات التصوير تعزز التصوير والقياس على مستوى الخلية المفردة.
الطرق المستخدمة
- التصوير الفلوري المناعي المتعدد
- تحليل الخلية المفردة في سياقات فيروسية مختلفة
- تقنيات التضخيم الهجين الفلوري
النتائج الرئيسية
- التسمية والتصوير المتزامن للحمض النووي الريبي للفيروس المناعي البشري، والحمض النووي الريبي، والبروتين
- خصوصية عالية مع تفاعل متقاطع أدنى في مجموعات المسبارات
- تحليل كمي للحمض النووي الريبي الفيروسي أثناء عدوى التهاب الكبد الوبائي بي
الاستنتاجات
- تؤسس هذه الدراسة تقنية قوية لتتبع العمليات الفيروسية بدقة مكانية وزمنية عالية.
- تسهم النتائج في توفير رؤى قيّمة حول الآليات المسببة للأمراض والأهداف العلاجية المحتملة في علم الفيروسات.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
Simultaneous visualization of viral nucleic acids and proteins in single cells addresses a critical gap in antiviral target validation by enabling direct observation of replication dynamics. This capability supports mechanistic de-risking in early discovery by correlating nucleic acid expression with protein production across diverse viral systems. The method enhances predictive confidence in lead identification by providing spatially resolved, quantitative readouts of viral life-cycle stages.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by linking viral nucleic acid transcription to protein synthesis in individual infected cells.
- Operational Value: Reduces mechanistic ambiguity through direct co-localization of DNA, RNA, and protein targets without cross-reactivity between probe sets.
- Scientific Value: Supports functional target validation by visualizing active viral replication stages across HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika, and influenza models.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative fluorescence intensity measurements for viral RNA and protein levels, enabling dose-response assessment in compound screening.
- Operational Value: Produces standardized, reproducible single-cell readouts compatible with confocal microscopy for high-content applications.
- Scientific Value: Facilitates assay readiness for antiviral screening by providing simultaneous nucleic acid and protein detection in fixed cells.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Tracks viral RNA accumulation over infection courses, such as HBV pre-genomic RNA increase, to inform pharmacokinetic/pharmacodynamic modeling.
- Operational Value: Enables high spatiotemporal resolution imaging of viral processes using 60X oil immersion objectives for detailed mechanistic studies.
- Scientific Value: Serves as a template for multiplexed imaging in broader cellular systems, supporting translational continuity from discovery to preclinical validation.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum by providing mechanistic insights post-target identification but prior to lead optimization, particularly for antiviral programs requiring validation of replication inhibitors.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by visualizing viral nucleic acid export and cytoplasmic protein synthesis in single cells.
- Screening: Delivers quantitative, multiplexed outputs that allow comparison of treatment effects on viral replication and protein expression.
- Analytics: Enables mean integrated fluorescence intensity quantification per cell, facilitating statistical comparison across experimental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical work by modeling viral RNA and protein dynamics relevant to inhibitor efficacy assessment.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform applicable to multiple viral pathogens without reformulation of core probe chemistry.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence through direct observation of viral nucleic acid-protein co-expression, reducing false positives in target validation.
- Operational Value: Ensures standardization via branched DNA ISH technology that improves sensitivity over conventional FISH and accommodates immunostaining compatibility.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by delivering spatially resolved mechanistic data on viral life-cycle progression.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of antiviral candidates based on concurrent nucleic acid and protein suppression metrics.
Implementation Considerations
- Requires expertise in multiplex immunofluorescence and branched DNA in situ hybridization probe handling.
- Depends on hybridization ovens, confocal microscopes, and hydrophobic barrier pens for slide preparation.
- Necessitates standardization of blocking, antibody incubation, and wash protocols across laboratories for reproducible results.
- Involves adaptation considerations when extending to new viral targets or cellular systems due to varying nucleic acid accessibility.
- Includes practical limitations such as the need for RNase treatment controls to confirm RNA-specific signal and overnight drying steps for sample mounting.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:24
Cell Seeding, Fixation and Permeabilization
1:40
Coverslip Immobilization and Protease Treatment
2:31
Target Probe and Amplifier Hybridization
3:40
Protein Immunostaining and Nuclear Counterstaining
4:48
Mounting
5:28
Results: Representative Single‐Cell Multiplexed Fluorescence Imaging
6:54
Conclusion
