سير عمل التصوير المقطعي للصفيف للحصول المستهدف على معلومات الحجم باستخدام المجهر الإلكتروني المسح الضوئي
July 15th, 2021
نحن نصف إعداد شرائط من المقاطع التسلسلية وجمعها على دعم نقل كبير لاستخدامها كعينات التصوير المقطعي الصفيف، جنبا إلى جنب مع إجراءات التصوير الآلي في المجهر الإلكتروني المسح الضوئي. يسمح البروتوكول بفحص واسترجاع وتصوير مستهدف للأحداث المحلية النادرة، والحصول على كميات كبيرة من البيانات.
تحليل المجهر الإلكتروني معقد في كثير من الأحيان. نحن نعتقد أن بروتوكولنا يسهل معالجة والحصول على بيانات EM من سطح العينة الكبيرة والحجم المتوسط. يساعد بروتوكولنا في العثور على الهياكل المستهدفة في الأقسام التسلسلية.
يقتصر تسجيل البيانات على ما هو ضروري. بالمقارنة مع الحصول على البيانات في كتل الأنسجة الكاملة ، يتم تقليل وقت التسجيل وتحليل البيانات أسهل. وبالنظر إلى السهولة العامة لهذا النهج، نعتقد أنه يمكن استخدامه ليس فقط لمعالجة المسائل العلمية، ولكن أيضا كأداة تشخيصية.
لإنشاء صفيف للتحليل ، قم أولا بتثبيت العينة على حامل الصفن الفائق واستخدم شفرة حلاقة لتقليم الراتنج حول العينة تقريبا. استخدم أداة تشذيب الألماس لصقل العينة واستخدام سكاكين التشذيب ذات الميل 20 أو 90 درجة لضمان أن الأسطح العلوية والسفلية للكتلة موازية لحافة السكين المتطورة. مزيج الزيلين والغراء في نسبة 3:1 واستخدام رمش تعلق على مسواك لتطبيق الخليط على الحواف العليا والسفلية من كتلة قلصت.
بينما الخليط هو التجفيف، واستخدام أداة شق رقاقة لقطع قطعة من رقاقة إلى الحجم المناسب للتحليل. تنظيف رقاقة في الماء المقطر لشطف بعيدا أي حطام وتنظيف السطح مع البلازما بعد رقاقة جافة. لإعداد سكين التصوير المقطعي صفيف، واستخدام الشريط لزجة رغوية لإرفاق إبرة إلى الجزء السفلي من سكين جامبو histo ووضع السكين في حامل microtome فائقة في درجة الصفر.
ضبط حافة السكين موازية لسطح الكتلة وجلب كتلة قلصت إلى حافة السكين في موقف جاهز للقسم. ضع الرقاقة النظيفة في حوض السكين واملأ الحوض بالماء إلى نفس مستوى حافة السكين ، ثم دع الحافة الماسية للسكين ترطيب بشكل صحيح ، باستخدام الحقنة المرفقة لإضافة أو سحب الماء حسب الضرورة. بالنسبة لقسم الصفيف، قم بتعيين الميكروتوم إلى نطاق قطع يتراوح بين 50 و100 نانومتر وسرعة قطع تتراوح بين 6 و1 ملليمتر في الثانية، وابدأ في التقسيم للحصول على شريط طويل بما يكفي لتغطية حجم Z المستهدف.
اعتمادا على حجم الكتلة ، وتجانس الأنسجة ، ونوع الراتنج ، سيكون الشريط مستقيما تقريبا. استخدم طرف رمش نظيف وغير لزج لفصل الأشرطة عن حافة السكين. استخدم رمش لتحريك الشريط برفق إلى وسط وسيط الدعم.
يمكن استخدام الكلوروفورم أو قلم التدفئة لتمديد القسم إذا لزم الأمر. بعد التمدد، تراجع عن الحقنة لبدء تصريف المياه. للحصول على شرائط أكثر حساسية، أو تراجع أبطأ للمياه، افصل الحقنة عن الخرطوم للسماح للمياه بالتنقيط.
عندما يصل مستوى المياه إلى مستوى الرقاقة، ادفع الشريط برفق إلى وسط الحوض و استمر في التصريف حتى تتم إزالة جميع المياه المتبقية بالكامل من الحوض. دع الرقاقة تجف في بيئة نظيفة. ويستغرق التجفيف حوالي 30 دقيقة.
عندما يتم تجفيف العينة بالكامل، قم بنقل الصفيف إلى صندوق مغلق بإحكام لحمايته من تلوث الأوساخ. وضع مربع في فرن 60 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل. للحصول على خريطة عامة لصور SEM تكشف عن مواقع المقاطع على الرقاقة، استخدم الكاميرا البصرية المدمجة للحصول على صورة SEM تغطي شريطا من المقاطع.
لإنشاء فسيفساء، انقر واسحب صورة الكاميرا للعينة وابدأ عملية الاستحواذ التلقائية. الحصول على نظرة عامة بدقة أعلى للعثور على الهياكل المستهدفة. إذا كان هناك عدد قليل من المقاطع التي تحتاج إلى تصوير، فاستخدم عارضا قابلا للتكبير لعرض الصور المكتسبة في مواقعها الأصلية.
بمجرد تحديد مقطع يجب أن يتم تصويره بدقة عالية، انقر واسحب لإنشاء منطقة تصوير، ثم حدد إعدادات التصوير عالية الدقة وقم بتخزين الإعدادات في قالب للعثور على أحداث نادرة صغيرة أو يصعب اكتشافها بشكل خاص، استخدم إعدادات التصوير عالية الدقة في كل قسم 10 أو على قسم واحد لكل شريط لإنشاء منطقة تصوير يدويا والحصول على الصور. ثم راجع الصور والأقسام التي تحتوي على منطقة الاهتمام. للحصول على أكثر من 10 مقاطع متتالية، استخدم الباحث عن المقطع لتحديد موقع كافة المقاطع تلقائيا.
إذا كانت الصور نظرة عامة لا تظهر مناطق واضحة من الاهتمام، والحصول على صور أعلى دقة من المقاطع واستخدام وظيفة معاينة القسم لإنشاء والحصول على الصور تلقائيا. لتحديد إعدادات التصوير الأمثل، قم بتنشيط التصوير المباشر في برنامج التحكم بالمجهر وانتقل إلى منطقة واحدة ذات أهمية، ثم قم بضبط إعدادات التصوير حتى تظهر الصور مناطق اهتمام واضحة، ولكن دون الحصول على صورة طويلة بشكل مفرط، وفقا لإرشادات الشركة المصنعة. لتحسين موضع مناطق التصوير على مقاطع متتالية، قم بتكبير الصورة ذات الاهتمام وانقر فوق بدء تحسين الموضع لزيادة دقة مواقع المقاطع المسجلة.
لتعريف منطقة تصوير، انقر فوق أي مقطع واسحبه أثناء الضغط باستمرار على المفتاح Alt وحدد إنشاء صفيف مجموعة تجانب من قائمة السياق المنبثقة. سيقوم البرنامج بإنشاء مناطق تصوير في نفس الموقع النسبي في جميع الأقسام التي تم العثور عليها أو تم وضع علامة عليها مسبقا. ثم قم بإعداد عدد البكسل وحجم البكسل وتخطيط التجانب ووقت البكسل في كل سلسلة صور حسب الحاجة.
لتكوين الدالة التلقائية، قم بإنشاء سلسلة صور منفصلة للوظائف التلقائية كما هو موضح، ونقل سلسلة الصور إلى موضع في القسم الذي يحتوي على بنيات عالية التباين. تعيين سلسلة الصور إلى 1024 × 884 بكسل وحدد حجم بكسل المطابق لأعلى دقة المستخدمة في سلسلة الصور. في قائمة وظائف السيارات، تحقق من التركيز التلقائي ووصمة العار التلقائي.
حدد قسم في عناصر التحكم تسلسل الاستحواذ وتأكد من أن صورة الدالة التلقائية هي العنصر الأول في القائمة، ثم انقر فوق الحصول على الكل لبدء الحصول على الصورة. عندما يتم إنشاء كافة سلسلة التصوير وإعدادها، سيتم سرد السلسلة في قائمة انتظار مهام. يمكن إجراء عملية الاستحواذ منخفضة الدقة يدويا أو تلقائيا مباشرة على أجزاء محددة من القسم أو مقطع بأكمله باستخدام تصوير فردي أو فسيفساء ، يليه خياطة.
ويمكن بعد ذلك الحصول على صور من المنطقة المختارة باستخدام معلمات عالية الدقة لتصور الميتوكوندريا والنوى والميكروفيليا، على سبيل المثال، بعد اختيار الاستحواذ التلقائي على خرائط الفسيفساء التي تم حلها، يمكن اقتصاص العديد من المناطق ذات الاهتمام أو استخدامها لتحديد مناطق تصوير محلية إضافية داخل المناطق. على الرغم من أن أنواع الخلايا المتخصصة المختلفة في القناة الهضمية Drosophila يتم توزيعها عشوائيا ، إلا أنه يمكن تمييزها بصريا بعد فحص الصور باستخدام معلمات عالية الدقة ، إما من أقسام واحدة أو مجموعة من الصور التسلسلية. بعد المحاذاة، يمكن عرض المكدسات باستخدام حلول برامج مختلفة.
يسمح تحليل التصوير المقطعي للصفيف بإنشاء العديد من المقاطع التسلسلية على الرقاقة المفردة، ويتم فحصها باستخدام معلمات منخفضة الدقة لترجمة المناطق العامة ذات الاهتمام. ويمكن استهداف هذه المجالات لإجراء مزيد من التحليل باستخدام بارامترات متقدمة للاستحواذ. على سبيل المثال، الانقسامات النطية في notum ليس من السهل توطينها على المستوى الهيكلي الفائق، حيث أن الخلايا كبيرة نسبيا مقارنة بمنطقة الخراج.
باستخدام هذا الأسلوب، ومع ذلك، يمكن استخدام الصور نظرة عامة تلقائية متوسطة الدقة من القفزات من 20 إلى 40 مقطعا لترجمة الخلايا المقسمة. يوفر إجراء التصوير المقطعي للصفيف تحليلا أكثر مباشرة لبيانات المجهر الإلكتروني. نحن نشجع المشاهدين على الاستثمار في اتقان التجديد والتعرف على سير العمل المتعلق بالخرائط في تجربتنا ، تتطلب بعض موضوعات البحث التحليل الهيكلي للغاية لحيوانات بأكملها أو أعضاء كاملة.
تساعد طريقتنا في توطين الخلايا بشكل سريع وشركائها في التفاعل في الأنسجة.
المراجع
تقدم هذه الدراسة بروتوكولًا لتحضير شرائط من المقاطع المتسلسلة لتحليل توموجرافيا المصفوفة باستخدام التصوير الآلي في مجهر إلكتروني ماسح (SEM). تسهل الطريقة الفحص الفعال واسترجاع الأحداث النادرة الموضعية داخل أحجام العينات الكبيرة، مما يقلل بشكل كبير من أوقات تسجيل البيانات مقارنة بطرق الكتلة النسيجية التقليدية.
مكونات الدراسة الرئيسية
منطقة البحث
- المجهر الإلكتروني
- تقنيات الحصول على الصور
- منهجيات تحضير العينات
الخلفية
- تعقيد تحليل بيانات المجهر الإلكتروني
- أهمية التصوير المستهدف للهياكل النادرة
- الحاجة إلى تحسين الكفاءة في معالجة العينات
الطرق المستخدمة
- تحضير المقاطع المتسلسلة الرقيقة للغاية
- استخدام أداة القطع الدقيق والسكاكين الماسية
- بروتوكولات التصوير الآلي SEM
النتائج الرئيسية
- بروتوكول مبسط لتحضير وتصوير المقاطع المتسلسلة
- تقليل وقت التصوير مع قدرات محسنة لتحليل البيانات
- فعالية الطريقة في تحديد الهياكل المستهدفة
الاستنتاجات
- يظهر البروتوكول مزايا كبيرة في الحصول على بيانات المجهر الإلكتروني
- يوفر أداة تشخيصية للاستفسارات العلمية حول الهياكل الخلوية
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Array tomography in SEM enables precise localization of target structures within large sample volumes, reducing unnecessary data acquisition and improving efficiency in discovery workflows. This approach supports rapid identification of rare cellular events, enhancing predictive confidence in target validation and mechanistic de-risking. The method facilitates translational continuity by preserving samples for repeated imaging and enabling scalable, reproducible analysis across discovery stages.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through precise localization of target areas in serial sections.
- Operational Value: Reduces data acquisition time by focusing imaging on relevant fractions of sample volume.
- Predictive Value: Supports biological de-risking by providing nanometer-resolution structural insights for organelle-level questions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Facilitates preparation of validated biological systems for downstream SEM imaging workflows.
- Operational Value: Enables array sectioning on wafers for standardized, repeatable sample preparation.
- Scalability: Supports creation of section libraries ready for repeated imaging and automated acquisition.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Conserves array tomography samples during imaging, allowing reuse for validation studies.
- Mechanistic De-risking: Provides quantitative structural data on mitochondria, nuclei, and microvilli to inform preclinical decisions.
- Predictive Confidence: Enables alignment of imaging data with disease-relevant systems through high-resolution parameter screening.
Pipeline & Workflow Integration
The array tomography workflow integrates into the discovery continuum by enabling early target localization, supporting lead identification through targeted high-resolution imaging, and informing preclinical validation via reproducible structural analysis.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by identifying rare events such as mitotic divisions in tissue samples.
- Screening: Delivers assay readiness through low-resolution overview imaging to localize areas of interest before high-resolution acquisition.
- Analytics: Generates quantitative dependent variable measurements via mosaic maps and aligned stacks for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical continuity through rendered sections that support biomarker alignment and structural validation.
- Enterprise Reuse: Positions the method as a reusable capability via section libraries stored in tightly-closed boxes and oven-stabilized for repeated imaging.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through nanometer-resolution imaging of cellular and structural details.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via automated SEM imaging protocols and section finder tools.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions by reducing late-stage biological risk through early structural de-risking.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization enabled by efficient acquisition of volume information from large sample surfaces.
Implementation Considerations
- Requires expertise in ultramicrotome operation, diamond knife handling, and wafer preparation techniques.
- Depends on instrumentation including ultramicrotome, plasma cleaner, syringe-based humidity control, and SEM with optical camera.
- Necessitates cross-team standardization of section thickness (50–100 nm), cutting speed (6–1 mm/s), and water basin protocols.
- Involves adaptation considerations for varying block size, tissue homogeneity, and resin type affecting ribbon straightness.
- Includes practical limitations such as the need for manual ribbon detachment using eyelash tips and water retraction timing for delicate samples.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:46
Array Generation
1:42
Sample Sectioning
2:23
Array Sectioning and Transfer
3:53
Scanning Electron Microscopy (SEM)
4:16
Imaging Region Definition
6:37
Auto Function Configuration and Image Acquisition
7:27
Results: Representative Targeted Acquisition of Volume Information
9:02
Conclusion
