هندسة الجينوم للخلايا B البشرية الأولية باستخدام CRISPR/Cas9

يسمح هذا البروتوكول للباحثين بالقضاء على الجين في الخلايا البائية بدقة لدراسة فقدان التأثيرات الوظيفية لهذا الجين أو إدخال جين متحول للتعبير الجيني المستقر الذي يمكن استخدامه لأغراض بحثية أو علاجية. الميزة الرئيسية لهذه الطريقة هي أنها توفر منصة عالمية تجعل من الممكن هندسة الخلايا البائية بسهولة ودقة ذات الكفاءات العالية. يمكن استخدام هذه الطريقة لهندسة الخلايا البائية للتعبير عن الأجسام المضادة المؤتلفة أو الإنزيمات ثم نقل تلك الخلايا البائية لعلاج الالتهابات أو في الاعتلالات الأنزيمية.

للبدء ، قم بإذابة الخلايا البائية في حمام مائي 37 درجة مئوية. أثناء الانتظار ، انقل ملليلترين من FBS الدافئ مسبقا إلى أنبوب مخروطي معقم سعة 15 ملليلترا. بمجرد إذابة الخلايا البائية تماما ، أضف على الفور ملليلتر واحد من FBS الدافئ مسبقا ، من حيث القطرة ، إلى العينة.

احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة. قم بتدوير الماصة برفق لإعادة تعليق العينة ونقل الحجم بالكامل، من حيث القطر، إلى أنبوب مخروطي يحتوي على ملليلترين من FBS الدافئ مسبقا. ارفع الحجم إلى 15 مل باستخدام PBS معقم ، ثم قم بتغطية الأنبوب واقلبه برفق مرتين إلى ثلاث مرات.

الطرد المركزي العينة عند 400 مرة G لمدة خمس دقائق ، ثم تخلص من المادة الطافية دون إزعاج حبيبات الخلية. أعد تعليق الحبيبات بملليلتر واحد من وسط تمدد الخلايا البائية المتوازن مسبقا وعد الخلايا. يجب أن يكون العدد الإجمالي للخلية حوالي 10 إلى الخلايا السابعة.

انقل الخلايا إلى قارورة تحتوي على 20 مل من وسط تمدد الخلية البائية المتوازن مسبقا. يجب أن يكون التركيز النهائي للخلايا حوالي خمسة أضعاف 10 إلى الخلايا الخامسة لكل مليلتر. احتضان القارورة عموديا في حاضنة زراعة الأنسجة.

قم بإعداد ركيزة النقل CRISPR / Cas9 عن طريق خلط ميكروغرام واحد من sgRNA المعدل كيميائيا مع 1.5 ميكروغرام من العقدية المقيحة المعدلة كيميائيا نواة Cas9 mRNA لكل تفاعل تعداد. للتحكم ، أضف ميكرولتر واحدا من المخزن المؤقت TE ، بدلا من sgRNA ، في أنبوب سعة 0.2 مليلتر من شريط ثمانية أنابيب. قم بتشغيل جهاز الثقب الكهربائي وقم بإعداد كواشف العدوى النووية.

عد ونقل 1 مليون خلية بائية لكل تفاعل تعداء ، إلى أنبوب مخروطي معقم. ارفع الحجم إلى 15 مل مع PBS المعقم وجهاز الطرد المركزي عند 400 مرة G لمدة خمس دقائق. بعد الطرد المركزي ، تخلص من المادة الطافية.

أعد تعليق الخلايا ب 10 مل من PBS المعقم وأجهزة الطرد المركزي عند 400 مرة G لمدة خمس دقائق ، ثم تخلص من المادة الطافية تماما دون إزعاج حبيبات الخلية. أضف 0.5 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي المرسال المعدل كيميائيا لكل 1 مليون خلية بائية إلى حبيبات الخلية. أعد تعليق الحبيبات ب 20 ميكرولتر من كاشف تعداء الخلية الأولية لكل 1 مليون خلية بائية واخلطها برفق عن طريق سحب العينات من خمس إلى ست مرات.

انقل 20.5 ميكرولتر لكل تفاعل تعداء إلى أنابيب سعة 0.2 مليلتر تحتوي على كاشف CRISPR / Cas9. الماصة لأعلى ولأسفل مرة واحدة لخلط ونقل الحجم بالكامل إلى كوفيت ترانسفيكشن. غطي الكوفيت واضغطي عليه برفق للتأكد من أن السائل يغطي قاع الكوفيت.

استخدم بروتوكول الخلية البائية الأساسية البشرية على المثقب الكهربائي للتعداد. ضع الخلايا المثقبة بالكهرباء في الكوفيت في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. ثم انقل 80 ميكرولترا من وسط تمدد الخلية البائية المتوازن مسبقا إلى تفاعل التعدي في الكوفيت.

ضع الكوفيت في حاضنة زراعة المناديل لمدة 30 دقيقة. قم برأس الأنبوب برفق عدة مرات لخلط ونقل الحجم الكامل للعينة من الكوفيت إلى بئر مناسب من صفيحة زراعة الأنسجة المكونة من 48 بئرا تحتوي على مليلتر واحد من وسط تمدد الخلية البائية. يجب أن يكون التركيز النهائي للخلايا 1 مليون خلية لكل مليلتر.

إجراء تجربة الجينات ، نقل ناقل الفيروس المؤتلف من النوع السادس المرتبط ب 500،000 من العدوى إلى البئر المناسب الذي يحتوي على خلايا كهربائية. ضع اللوحة في حاضنة زراعة الأنسجة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون مع الرطوبة. في تجربة الضربة القاضية ، أظهر عدد الخلايا البائية أكثر من 80٪ من الخلايا القابلة للحياة مع انخفاض طفيف في استعادة الخلايا في كل من عينات التحكم والضربة القاضية CD19 في 24 ساعة بعد التثقيب الكهربائي.

تم جمع الخلايا البائية في اليوم الخامس بعد التعدي لقياس التدفق الخلوي وتحليل المد والجزر. أظهرت مخططات التشتت التمثيلية لعينات التحكم والضربة القاضية 14 و 95٪ خلايا سلبية CD19 على التوالي ، مما يدل على انخفاض كبير في تعبير CD19 في عينات الضربة القاضية. أظهرت الكروماتوغرامات للتسلسل الجيني قمم مزدوجة في الخلايا البائية بالضربة القاضية CD19 ، مما يشير إلى إدخال أو حذف النيوكليوتيدات بعد فواصل مزدوجة الشريطة بوساطة CRISPR / Cas9.

أظهر تحليل Indel للكروماتوغرافيا لعينات الضربة القاضية نسبة عالية من تكوين indel في موضع CD19 ، وهو ما يتوافق مع النسبة المئوية لفقدان البروتين CD19 المكتشفة عن طريق قياس التدفق الخلوي. تم جمع الخلايا البائية من تجربة الضربة القاضية في اليوم 12 ، بعد الهندسة. أظهرت المخططات المبعثرة 64٪ من الخلايا الإيجابية ل EGFP في العينة التي تلقت الناقل الفيروسي المؤتلف من النوع السادس المرتبط بالأدينو ، جنبا إلى جنب مع RNP ، في حين لم يلاحظ أي أو الحد الأدنى من إيجابية EGFP في عينات التحكم والناقلات فقط على التوالي.

أظهر تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل تقاطع 1.5 أمبليكون زوج كيلو قاعدة في عينة الضربة القاضية ولم يلاحظ أي منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل في عينة التحكم أو العينة الناقلة فقط. أظهرت أعداد الخلايا أن العملية الهندسية تؤثر على استعادة الخلايا في عينة الضربة القاضية أكثر من عينات التحكم أو العينات المتجهة فقط. ومع ذلك ، سرعان ما انتعشت جميع العينات في غضون ثلاثة أيام بعد الهندسة.

يمكن أيضا استخدام هذا الإجراء لإدخال عوامل المحرر الأساسي لتغيير أزواج القواعد المفردة من أجل إحداث أو تصحيح طفرات أحادية النقطة في جينوم الخلية البائية. يمكن استخدامه أيضا لإدخال كودونات توقف مبكرة أو لتغيير مواقع لصق ، مما يسمح بالضربة القاضية الجينية المتعددة دون التعرض لخطر انتقال الكروموسومات. قبل تطوير هذه التقنية ، كانت هندسة الخلايا البائية البشرية تستفسر عن استخدام مناهج أخرى لهندسة الجينات الأكثر صعوبة.

هذه التقنية هي بديل أسهل وأقل تكلفة وأسرع. يمكن أيضا أن تستخدم لتوليف منتجات العلاج بالخلايا للاستخدام السريري.