فحص قياس الخلايا التدفقي القائم على الحمض النووي/Ki67 لتحليل دورة الخلية لخلايا CD8 T الخاصة بالمضاد في الفئران الملقحة
يناير 5, 2021
التوسع كلونال هو سمة رئيسية للاستجابة الخلية التائية الخاصة مستضد. ومع ذلك، فإن دورة الخلية من الخلايا التائية المستجيبة للمضاد قد تم التحقيق فيها بشكل سيئ، ويرجع ذلك جزئيا إلى القيود التقنية. نحن نصف طريقة تدفق القياسات الخلوية لتحليل Clonally توسيع خلايا CD8 T مستضد محددة في الطحال والغدد الليمفاوية من الفئران المطعمة.
يوفر بروتوكولنا نهجا عمليا يمكن من خلاله استخدام طحال الفأر والغدد الليمفاوية لتعكس ديناميكية استجابة الخلايا التائية أكبر من توفير لقطة فينوتبيك ثابتة الحالة. تقنيتنا بالكشف بحساسية مستضد محددة CD8 الخلايا التائية التي تشارك في الاستجابة الجارية. يتم قياس الخلايا التائية CD8 المنتشرة دون الآثار المحيرة المحتملة للعلاج الدوائي في الجسم الحي أو نقل الخلايا.
يمكن لتقنيتنا أن توفر نافذة في ديناميكيات المناعة في عدة إعدادات. على سبيل المثال، فيما يتعلق بالاستجابة للتطعيم والعدوى، وأمراض المناعة الذاتية، والعلاج المناعي للسرطان. إعداد الطازجة 1x permeabilization غسل العازلة عن طريق تخفيف 10x permeabilization العازلة مع الماء المقطر وتصفية من خلال مرشح 0.45 ميكرومتر للقضاء على المجاميع.
تمييع الأجسام المضادة أحادية النسيلة Ki67 FITC في 1x permeabilization غسل العازلة كما هو محدد مع تجربة المعايرة لحجم نهائي من 100 ميكرولتر لكل عينة. أضف 3 ملليلترات من حاجز غسل permeabilization 1x إلى كل أنبوب مع الخلايا والطرد المركزي في 400 G لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. تجاهل الناتنات الفائق.
مرة أخرى، إضافة 1x permeabilization غسل العازلة والطرد المركزي لبيليه الخلايا. ثم، تجاهل العملاق. إضافة 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة أحادية النسيلة المخفف Ki67 FITC إلى بيليه، ثم دوامة واحتضان لمدة 30 دقيقة في الظلام.
بعد الحضانة، اغسل الخلايا مرتين مع 4 ملليلتر من العازلة permeabilization 1x، الطرد المركزي بعد كل غسل، والتخلص من supernatant. إضافة 350 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني إلى بيليه الخلية لعينات ليتم الحصول عليها مباشرة في تدفق السيتومتر و 250 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني إلى بيليه الخلية لعينات ليتم احتضانها مع Hoechst لتلطيخ الحمض النووي. إعداد Hoechst و PBS الحل وإضافته إلى كل عينة بحيث يكون التركيز النهائي اثنين ميكروغرام لكل ملليلتر.
دوامة واحتضان العينات لمدة 15 دقيقة في الظلام. ثم، طرد مركزي العينات لمدة خمس دقائق وإضافة 350 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني إلى بيليه الخلية. افتح البرنامج وإنشاء مجموعات مختلفة مطابقة للأجهزة المختلفة لتحليلها بالنقر فوق إنشاء مجموعة"في مقطع شريط مساحة العمل.
افتح إطار المجموعة المعدلة بالنقر المزدوج على اسم المجموعة ومزامنة المجموعات التي تم إنشاؤها حديثا عن طريق إدراج علامة اختيار على الدالة المتزامنة. اسحب كل ملف FCS إلى المجموعة المقابلة، ثم قم بإنشاء استراتيجية gating بدءا من مجموعة LN. افتح إطار الرسم البياني بالنقر المزدوج فوق العينة الملطخة بالكامل لعرض الأحداث غير المحصل عليها التي تم الحصول عليها للعينة في رسم نقطة.
لاحظ أن المحورين س و ص يتم تصنيفهما كما في ملفات FCS، كما هو مبين في الجدول الثاني من ملف إعدادات مقياس التدفق الخلوي لهذه المخطوطة. تحقق من عرض عدد كاف من الأحداث للتصور المناسب. إذا لزم الأمر، افتح التفضيلات بالنقر فوق رمز القلب في شريط مساحة العمل، وحدد الرسوم البيانية، ثم دوت بلوت"كنوع الرسم البياني، وتحقق من أن عدد النقاط المرسومة في المربع المقابل صحيح أو تغييره.
عرض الأحداث غير المغضى بها في إطار الرسم البياني في رسم نقطة مع DNA-A على المحور س والحمض النووي W على المحور ص. استخدم مقياس خطي لكلا المحورين. إذا لزم الأمر تغيير مقياس من لوغاريتمية إلى خطية بالنقر على المربع المشار إليه مع T قريبة من كل محور في إطار الرسم البياني.
حدد مجموعة خلايا مفردة بالنقر فوق مستطيل في قسم أداة gating ثم انقر نقرا مزدوجا فوق في وسط البوابة المستطيلة لعرض خلايا مفردة في مخطط نقطة مع المعلمة FSC-A على المحور س والخلية الميتة يموت على المحور ص. انقر على المضلع لتحديد السكان الخلية الحية، والتي هي سلبية للموت الخلية الميتة. انقر نقرا مزدوجا فوق في وسط بوابة المضلع لعرض الخلايا في رسم نقطة مع المعلمة FSC-A على المحور س والمعلمة SSC-A على المحور ص.
انقر على المستطيل وإنشاء بوابة مريحة لتشمل جميع الخلايا الحية واحدة في هذا الرسم البياني. انقر نقرا مزدوجا في وسط البوابة المريحة لعرض الخلايا في رسم نقطة مع CD3 على المحور س وCD8 على المحور ص. استخدم مقياس الوصول المناسب للتصور في إطار الرسم البياني.
إذا لزم الأمر، قم بتعديل مقياس x و y بالنقر فوق المربع، المشار إليه ب T بالقرب من كل محور، واختر تخصيص وظيفة Access، وتعديل عقود neg الإضافية مع القواعد والعقود الإيجابية حسب الضرورة. حدد خلايا CD3+CD8+بالنقر فوق المضلع. انقر نقرا مزدوجا فوق في وسط بوابة CD3+CD8+لعرض الخلايا في رسم نقطة مع Tetr-gag على المحور س وخمامة Pent على المحور ص.
حدد مستضد خلايا CD8 T محددة عن طريق النقر على المضلع. انقر نقرا مزدوجا في وسط البوابة الخاصة بالهفوة لعرض الخلايا في مؤامرة نقطة مع DNA-A على المحور س وKi67 على المحور ص. حدد الخلايا في مراحل دورة الخلية المختلفة عن طريق النقر على رباعية "في قسم أداة gating من إطار الرسم البياني.
نسخ استراتيجية gating التي تم إنشاؤها في عينة واحدة إلى المجموعة المقابلة لتطبيق البوابات على كافة عينات المجموعة. ثم نسخ استراتيجيات gating لمجموعات ب الطحال وCBM ، كما هو موضح في المخطوطة النصية. تحقق من أن كافة البوابات مناسبة لكل عينة من المجموعات الثلاث.
إذا لزم الأمر، قم بإزالة تزامن المجموعة وتعديل البوابات كما هو موضح في المخطوطة. عرض خلايا BM من البوابة استرخاء في مؤامرة نقطة مع الحمض النووي-A على المحور س وKi67 على المحور ص. تصور النتائج بالنقر على محرر تخطيط"في قسم شريط مساحة العمل.
اسحب كل بوابة من استراتيجية gating في جزء العينة إلى محرر التخطيط ووضع المؤامرات وفقا لتسلسل gating. إذا لزم الأمر، قم بتغيير نوع الرسم البياني بالنقر المزدوج على الرسم المطابق في التخطيط وتحديد النوع المناسب في إطار تعريف الرسم البياني. انقر على المجموعة ويكرر حسب الوظائف على الشريط تخطيط لتصور النتائج التي تم الحصول عليها في خلايا CD8 T مستضد محددة من كل جهاز ومقارنة عينات مختلفة.
تصور نتائج خلايا نخاع العظم التي تمثل تحكما إيجابيا. يظهر هنا مثال نموذجي لتحليل دورة الخلية لخلايا نخاع العظم. وأسفر البروتوكول عن معامل منخفض للتباين بين G0 و G1 و G2 إلى M قمم الحمض النووي، مما يشير إلى جودة ممتازة لتلطيخ الحمض النووي.
واستخدمت استراتيجية لتكئة الخطوات الخمس لتحديد خلايا CD8 محددة مستضد. تم استخدام اثنين من multimers لتحسين حساسية الكشف عن الخلايا CD8 T الخاصة بالهفوة في الفئران الملقحة دون زيادة خلفية التلطيخ في الفئران غير المعالجة. تحتوي خلايا CD8 T الخاصة بالهفوة في الغدد الليمفاوية المستنزفة وفي الطحال على نسبة عالية من الخلايا في مراحل S-G2/M في اليوم الثالث بعد الدفعة.
وعلاوة على ذلك، كان خلايا CD8 T الخاصة بالكمامة في مراحل S-G2/M عالية FSC-A و SSC-A عندما تم تراكبها على إجمالي خلايا CD8 T من نفس الجهاز. وأظهرت الرسوم التوضيحية تعويض أن التعبير CD62L بواسطة خلايا CD8 T الخاصة بالكمامة منخفضة، كما هو متوقع للخلايا التائية المنشطة، باستثناء عدد قليل من الخلايا في G0 في الغدد الليمفاوية. تم تصميم هذه الطريقة للخلايا التائية لتحقيق نوعية ممتازة من تلطيخ الحمض النووي جنبا إلى جنب مع الغشاء وتلطيخ Ki67.
تحليل بيانات قياس التدفق الخلوي هو نقطة رئيسية. تأكد من استخدام عنصر التحكم المناسب لتحديد موقع البوابة. باستخدام هذه الطريقة، اكتشفنا الخلايا التائية في مراحل S-G2/M من دورة الخلية في الماوس والدم المحيطي البشري.
كانت هذه التقنية مفيدة في دراسات مراقبة المناعة في داء السكري من النوع 1 ، وداء كريات الدم البيضاء المعدي ، و COVID-19.
نظرة عامة
تقدم هذه الدراسة طريقة تعتمد على قياس التدفق الخلوي لتحليل خلايا CD8 T النوعية للمستضد والتي تتوسع نسلياً في الطحال والعقد اللمفاوية للفئران الملقحة. تتيح هذه التقنية الكشف عن استجابات خلايا T دون التأثيرات المربكة الناتجة عن العلاج الدوائي داخل الجسم أو نقل الخلايا.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- علم المناعة
- قياس التدفق الخلوي
- بيولوجيا الخلايا التائية
خلفية علمية
- يعد التوسع النسيلي أمراً بالغ الأهمية لاستجابات الخلايا التائية النوعية للمستضد.
- لم يتم استكشاف الدورة الخلوية للخلايا التائية المستجيبة بشكل كافٍ بسبب التحديات التقنية.
- يعد فهم ديناميكيات الخلايا التائية ضرورياً للحصول على رؤى حول الاستجابات المناعية.
- تعالج هذه الدراسة الحاجة إلى طريقة لتحليل استجابات الخلايا التائية في الوقت الفعلي.
الغرض من الدراسة
- تطوير طريقة لتحليل خلايا T CD8 النوعية للمستضد في الجسم الحي.
- تقديم رؤى حول تكاثر خلايا T أثناء الاستجابات المناعية.
- تسهيل دراسة ديناميكيات خلايا T في سياقات مناعية مختلفة.
الطرق المستخدمة
- تحضير محلول غسيل النفاذية الطازج لصبغ الخلايا.
- استخدام الجسم المضاد أحادي النسيلة Ki67 FITC للكشف عن الخلايا التائية المتكاثرة.
- تحليل قياس التدفق الخلوي لتقييم مجموعات الخلايا التائية وحالات تنشيطها.
- استراتيجيات تحديد البوابات لعزل الخلايا التائية CD8 النوعية للمستضد من المجموعات المختلطة.
النتائج الرئيسية
- تنجح هذه الطريقة في الكشف عن خلايا CD8 T النوعية للمستضد والمشاركة في استجابات نشطة.
- يمكن قياس تكاثر خلايا CD8 T بدقة دون تداخل من متغيرات مربكة.
- تكشف هذه التقنية عن رؤى حول ديناميكيات الخلايا التائية أثناء التطعيم والعدوى.
- تظهر النتائج فائدة هذه الطريقة في دراسة أمراض المناعة الذاتية والعلاج المناعي للسرطان.
الاستنتاجات
- تعد طريقة قياس التدفق الخلوي المطورة فعالة لتحليل استجابات الخلايا التائية.
- يعزز هذا النهج من فهم الديناميكيات المناعية في سياقات مختلفة.
- يمكن للدراسات المستقبلية الاستفادة من هذه التقنية لاستكشاف سلوك الخلايا التائية في حالتي الصحة والمرض.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
تمكّن هذه الطريقة من التحديد الكمي الدقيق لتكاثر خلايا CD8 T النوعية للمستضد داخل الجسم الحي، مما يعالج فجوة حرجة في الرصد المناعي لتطوير اللقاحات والعلاجات المناعية. ومن خلال التمييز بين أطوار G0 و G1 و S-G2/M دون الاعتماد على نظائر النيوكليوتيدات أو تخفيف الصبغة، فإنها توفر لقطة ميكانيكية لديناميكيات التوسع النسيلي. ويدعم ذلك التحقق من صحة الأهداف وتحديد المركبات الرائدة من خلال ربط الارتباط بالمستضد بحالات التكاثر الوظيفية في النماذج قبل السريرية.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية البيولوجية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: تتيح استقصاء الفرضيات العلاجية من خلال ربط خصوصية المستضد بتقدم الدورة الخلوية في الخلايا التائية المستجيبة.
- القيمة التشغيلية: توفر قراءة قابلة للتكرار عبر قياس التدفق الخلوي للتحقق من فعالية الهدف بشكل مستقل عن قيود BrdU أو CFSE.
- القيمة التنبؤية: تدعم تقليل المخاطر الميكانيكية عن طريق تحديد نسبة الخلايا التائية ذات الخصوصية للمستضد الملتزمة بالانقسام الفتيلي مقابل تلك الموجودة في طور G1 أو G0.
الفحص وتطوير المقايسة
- جاهزية المقايسة: تولّد مخرجات كمية معيارية (DNA-A مقابل Ki67) مناسبة للفحص عالي الإنتاجية لمرشحات اللقاحات أو المعدلات المناعية.
- قابليّة التكرار: تستخدم صبغة Hoechst 33342 للتمييز عالي الدقة بين قمم DNA، مما يضمن فصلاً متسقاً لمراحل G0/G1 وG2/M عبر العينات.
- قابليّة التوسع: متوافقة مع تحليل الأعضاء المتعددة (الطحال، والعقد الليمفاوية، ونخاع العظم) وقابلة للتكيف مع الأنواع قبل السريرية لإجراء مقارنات بين الدراسات.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- الأهمية المرضية: قابلة للتطبيق في دراسات فعالية اللقاحات، كما ظهر في الفئران الملقحة بنواقل HIV-gag التي أظهرت إثراءً لـ S-G2/M في خلايا CD8 T النوعية للمستضد.
- الاستمرارية الانتقالية: تعمل كجسر بين مرحلتي الاكتشاف والمرحلة قبل السريرية من خلال توفير قياس محلل حركياً لتوسع خلايا T يكون تنبؤياً بحجم الاستجابة المناعية.
- القرارات المعدلة حسب المخاطر: تتيح تحديد معايير المضي قدماً أو التوقف (go/no-go) بناءً على حركية تكاثر النسائل النوعية للمستضد، مما يقلل الاعتماد على المؤشرات المظهرية النهائية وحدها.
تكامل مسار العمل وسير العمل
يندرج هذا المقايسة ضمن التسلسل الممتد من مرحلة الاكتشاف إلى المرحلة قبل السريرية، مما يتيح التقييم المبكر لقدرة الخلايا التائية على التكاثر بعد التحصين، ويوفر بيانات تدعم تحسين المرشحات الرائدة من خلال التنميط المناعي الوظيفي.
- بيولوجيا الاكتشاف: تدعم اختبار الفرضيات من خلال ربط التعرف على المستضد (عبر MHC-multimer) بحالة الدورة الخلوية، مما يوضح ما إذا كان هذا الارتباط يحفز التكاثر أو يؤدي إلى حالة الوهن المناعي.
- الفحص: توفر بيانات كمية حول توزيع الدورة الخلوية جاهزة للتحليل، وذلك لمقارنة منصات اللقاحات أو تأثيرات المواد المساعدة على توسع الخلايا التائية.
- التحليلات: تولد قراءات متعددة المعايير (محتوى DNA، وKi67، والتشتت، والنوعية للمستضد) مما يسمح بالمقارنة الإحصائية لمؤشرات التكاثر عبر ظروف مختلفة.
- الأبحاث الانتقالية: تربط النتائج بالتحقق قبل السريري من خلال تحديد مجموعات فرعية من الخلايا التائية المنشطة والتي تمر بالدورة الخلوية، والتي ترتبط بالمناعة الواقية في نماذج العدوى والسرطان.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: تؤسس منصة مراقبة مناعية قابلة لإعادة الاستخدام للدراسات الطولية في مسارات أبحاث أمراض المناعة الذاتية، والأمراض المعدية، وعلم الأورام المناعي.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تزيد من الثقة التنبؤية في التحقق من الهدف من خلال معالجة التباين التكاثري ضمن مجموعات الخلايا التائية النوعية للمستضد.
- القيمة التشغيلية: تحقق التوحيد القياسي من خلال استراتيجية تحديد بوابات ثابتة وتلوين DNA القائم على صبغة Hoechst، مما يقلل من التباين بين المقايسات.
- القيمة الاستراتيجية: تحسن كفاءة رأس المال من خلال تمكين التخفيف المبكر للمخاطر للمرشحات المعدلة للمناعة بناءً على حركية الخلايا التائية الوظيفية.
- التأثير على المحفظة: توجه التقدم المعدل حسب المخاطر من خلال قياس الجزء التكاثري للخلايا التائية النوعية للمستضد كمؤشر حيوي لجودة الاستجابة.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في قياس التدفق الخلوي متعدد الألوان، بما في ذلك ضوابط التعويض لإشارات FITC-Ki67 و Hoechst.
- يستلزم توفر جهاز قياس التدفق الخلوي القادر على الإثارة بالأشعة فوق البنفسجية للكشف عن Hoechst 33342 مع مجموعات المرشحات المناسبة.
- يتطلب بروتوكولات موحدة للنفاذية والغسيل للحفاظ على سلامة الحاتمات لـ Ki67، والبوليمرات المتعددة، وعلامات السطح.
- يتضمن تحسين تركيز Hoechst (2 µg/mL) ووقت الحضن لتجنب السُمية الخلوية مع تحقيق الدقة المثلى لذروة DNA.
- يعتمد على تسلسل هرمي صحيح لعملية التحديد (gating)، يبدأ باستبعاد الخلايا المتكتلة والخلايا الميتة، لضمان التحديد الدقيق للخلايا التائية النوعية للمستضد.
