طريقة تدخل الحمض النووي الريبي بوساطة كهربائية في أودوناتا
فبراير 6, 2021
نحن نقدم بروتوكولا مفصلا لتدخل الحمض النووي الريبي بوساطة كهربائية في حشرات النظام Odonata (اليعسوب وdamselflies) باستخدام السد الأزرق الذيل(Ischnura senegalensis: Coenagironidae: Zygoptera) واليعسوب المقشود pied(Pseudothemis zonata: التشهير: Anisoptera).
هذا هو بروتوكول الفيديو لأسلوب تدخل الحمض النووي الريبي بوساطة كهربائية في أودوناتا. اليعسوب وdamelflies ، وأعضاء في النظام Odonata ، هي من بين الحشرات الأكثر أجداد. البالغين أودوناتا تظهر تنوع ملحوظ في ألوان الجسم وأنماط، وأجريت العديد من الدراسات الإيكولوجية والسلوكية.
ومع ذلك، كانت الدراسات الوراثية الجزيئية في أودوناتا تفتقر، لأن التحليل الوظيفي للجينات أمر صعب للغاية. على سبيل المثال، الطريقة RNAi التقليدية ليست فعالة في أنواع أودوناتا. في الآونة الأخيرة، أنشأنا طريقة RNM في تركيبة مع في الكهربائية في الجسم الحي.
هنا، ونحن نقدم بروتوكول الفيديو لRNAi بوساطة الكهربائية في كل من اليعسوب وdamelflies. كما لدينا الأنواع السدود تمثيلية نستخدم السد الأزرق الذيل. (أيشنورا) السنغالي.
هذا هو واحد من الأنواع الأكثر شيوعا damselfly وغالبا ما توجد في البرك المشمسة في اليابان. أولا، نعرض بروتوكول RNAi التي تستهدف البطن من damselfly، اشنورا السنغالية. بعد التخدير البارد في الجليد في أن اثنين من الدبابيس على جانبي البروثوراس وإصلاح اليرقة إلى موقف ثابت.
سحب وتمتد الغشاء بين القطاعية بين الجزء البطني السابع والثامن باستخدام ملقط. الحفاظ على الغشاء بين القطاعية امتدت باليد. أدخل طرف الشعيرات الدموية المعدة في الغشاء المتمدد بين القطاعات.
حقن 1 ميكرولتر من محلول سيرنا أو dsRNA. تطبيق اثنين من قطرات من هلام الموجات فوق الصوتية على سطح اليرقات باستخدام ملقط. وضع الأقطاب الكهربائية على هلام الموجات فوق الصوتية، مع القطب الموجب على جانب الحقن.
توليد نبضات كهربائية 10 مرات باستخدام كهربائي. امسح الجل المتبقي على السطح بورق. إزالة دبابيس الحشرات والحفاظ على اليرقات المعالجة على منشفة ورقية مبللة لمدة يوم واحد تقريبا للانتعاش.
بعد ذلك، نعرض بروتوكول RNAi الذي يستهدف الصدر من damnnsis damselfly، Ischnura السنغال. بعد التخدير البارد الجليد نعلق اثنين من دبابيس على جانبي البروثوراس وإصلاح اليرقة إلى موقف ثابت. سحب وتمتد الغشاء بين القطاعات بين prothorax وsthorax باستخدام اليد.
أدخل طرف الشعيرات الدموية المعدة في الغشاء المتمدد بين القطاعات. حقن ميكرولتر واحد من محلول سيرنا أو ديسرنا. تطبيق اثنين من قطرات من هلام الموجات فوق الصوتية على سطح اليرقة باستخدام ملقط.
وضع الأقطاب الكهربائية على هلام الموجات فوق الصوتية، مع القطب الموجب على جانب الحقن. توليد نبضات كهربائية 10 مرات باستخدام الكهربائي. امسح الجل المتبقي على السطح بورق.
إزالة دبابيس الحشرات والحفاظ على اليرقات المعالجة على منشفة ورقية مبللة لمدة يوم واحد تقريبا للانتعاش. كجنس اليعسوب التمثيلي نستخدم اليعسوب المكشط بيد. (بُوُوثيميس زونتا)
هذا هو واحد من أنواع اليعسوب الأكثر شيوعا وغالبا ما توجد في البرك ظليلة في اليابان. وأخيراً، نعرض بروتوكول RNI الذي يستهدف بطن اليعسوب، Pseudothemis zonata. تمتد الغشاء بين القطاعات بين الجزء الرابع والخامس من البطن.
جعل ثقب صغير مع إبرة غرامة بين الجزء الرابع والخامس من البطن. إدراج غيض من شعرية معدة في حفرة المعدة. حقن ميكرولتر واحد من محلول سيرنا أو ديسرنا.
إصلاح اليرقة إلى موقف ثابت باستخدام دبابيس. تطبيق اثنين من قطرات من هلام الموجات فوق الصوتية على سطح اليرقات باستخدام ملقط. ضع أقطاب كهربائية على جل الموجات فوق الصوتية مع القطب الموجب على جانب الحقن.
توليد نبضات كهربائية 10 مرات باستخدام كهربائي. امسح الجل المتبقي على السطح بورق. إزالة دبابيس الحشرات والحفاظ على اليرقات المعالجة على منشفة ورقية مبللة لمدة يوم واحد تقريبا للانتعاش.
هنا اخترنا جين تخليق الميلانين MCO2 الجين المستهدف ، وEGFP أو bla كهدف تحكم سلبي. MCO2 ضروري لتشكيل اللون الأسود في الحشرات المختلفة. أولا نعرض النتائج في البطن من سيسنورا سنينسنينسيس.
تشير رؤوس الأسهم البيضاء إلى مناطق التصبغ الأسود المكبت حيث تم وضع القطب الموجب على الإلكتروبوريشن. وقد لوحظ احتضان التصبغات من خلال العلاج من قبل الرنا وعلاج DSRNA. 21- وقد تباينت طبيعة النمط الظاهري للنمط الظاهر في RNI وموقعه تفاوتاً كبيراً بين الأفراد.
دون electroporation لم يلاحظ أي الأنماط الظاهرية RNI، مما يشير إلى أن الكهربائي ضروري لRNI في هذا النوع. بعد ذلك، نعرض النتائج في صدر اشنورا سنينسنسيس. وبالمثل لوحظ تثبيط التصبغ الأسود في جميع أنحاء المنطقة حيث تم وضع القطب الموجب على electroporation.
وأخيرا، نعرض النتائج في البطن من زوناتا الزائفة. وكما هو متوقع، تم الكشف عن النمط الظاهري RNI في جميع أنحاء المنطقة حيث تم وضع القطب الموجب على الأقطاب الكهربائية. ونؤكد أن الأسلوب RNAi بوساطة البروفة الكهربائية مفيد جدا في أودوناتا.
يمكن أن تحفز على قمع الجينات المحلية ما يقرب من 100٪ كفاءة. على الأقل في البشرة، عندما نختار مراحل النمو المناسبة. هذا الأسلوب على عدة عبر أسلوب CRISPR/Cas9.
على سبيل المثال، يمكن التحكم في المنطقة التي تظهر فيها الأنماط الظاهرية RNAi من خلال موضع الأقطاب الموجبة عند الكهربة، ويمكن مقارنة الأنماط الظاهرية للرنا بسهولة مع الأنماط الظاهرية للتحكم جنبًا إلى جنب في نفس الفرد. وعلاوة على ذلك، هذه الطريقة لا تتطلب الحقن المجهري في البيض صغيرة. لذلك فمن الأسهل بكثير وأسرع لمراقبة النمط الظاهري أسرع من أسلوب CRISPR / Cas9.
وعلاوة على ذلك ، يمكن تطبيق هذه الطريقة على الحشرات التي يصعب جمع بيضها الذي تم وضعه حديثًا. على سبيل المثال، تضع الإناث من Pseudothemis zonata البيض أثناء الطيران. لذلك فمن الصعب جدا لجمع البيض وضعت حديثا.
ونتوقع أن يكون هذا البروتوكول قابلاً للتطبيق عموماً على الكائنات غير النموذجية عندما لا يعمل نظام RNI التقليدي بكفاءة.
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة بروتوكولاً مفصلاً للتداخل الحمض النووي الريبي بوساطة الكهربائي (RNAi) في Odonata، مستهدفة تحديدًا الزنابير ذي الذيل الأزرق (Ischnura senegalensis) ويعسوب السكيمر المتعدد الألوان (Pseudothemis zonata). تعالج هذه الطريقة التحديات في تحليل وظيفة الجينات في هذه الحشرات، وتوفر تقنية موثوقة للدراسات الجينية الجزيئية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- علم الوراثة
- علم وظائف الأعضاء الحشري
الخلفية
- تعد Odonata من بين أقدم الحشرات.
- الطرق التقليدية للتداخل الحمض النووي الريبي غير فعالة في هذه الأنواع.
- يوفر الكهربائي نهجًا جديدًا لقمع الجينات.
- أبرزت الدراسات السابقة الحاجة إلى تقنيات جزيئية فعالة في الكائنات غير النموذجية.
غرض الدراسة
- لتأسيس بروتوكول موثوق للتداخل الحمض النووي الريبي باستخدام الكهربائي في Odonata.
- لإظهار فعالية هذه الطريقة في تحليل وظيفة الجينات.
- لتوفير بروتوكول مفصل وقابل للتكرار للباحثين.
الطرق المستخدمة
- التداخل الحمض النووي الريبي بوساطة الكهربائي مستهدفًا أجزاء الجسم المحددة.
- استخدام محاليل siRNA أو dsRNA لقمع الجينات.
- تطبيق هلام الموجات فوق الصوتية ونبضات الكهربائي.
- انتعاش اليرقات المعالجة لملاحظة أنماط التداخل الحمض النووي الريبي.
النتائج الرئيسية
- لوحظ قمع الجينات بنجاح في كل من أنواع الزنابير واليعسوب.
- مكن الكهربائي التداخل الحمض النووي الريبي المستهدف بكفاءة عالية.
- تنوعت الأنماط بين الأفراد، مما يشير إلى فعالية الطريقة.
- أظهر المقارنة مع الأنماط الضابطة نتائج واضحة.
الاستنتاجات
- يعد التداخل الحمض النووي الريبي بوساطة الكهربائي أداة قيّمة لدراسة وظيفة الجينات في Odonata.
- هذه الطريقة أسهل وأسرع من مناهج CRISPR/Cas9 التقليدية.
- يمكن تطبيقها على كائنات غير نموذجية أخرى حيث يفشل التداخل الحمض النووي الريبي التقليدي.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
Electroporation-mediated RNA interference (RNAi) in Odonata enables functional genomics in previously intractable insect systems, addressing a critical gap in target validation for non-model organisms. This method provides a robust platform for dissecting gene function in developmental, pigmentation, and morphogenesis pathways, supporting predictive confidence at early discovery inflection points. Its applicability to species with challenging life cycles expands the portfolio of tractable models for biopharma R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of gene function in ancestral insect lineages.
- Facilitates mechanistic de-risking by allowing spatially controlled gene suppression.
- Supports functional target validation in systems where conventional RNAi is ineffective.
- Improves predictive confidence for pathway and phenotype linkage in non-model organisms.
Screening & Assay Development
- Prepares validated biological systems for downstream phenotypic screening workflows.
- Delivers reproducible, localized gene suppression for quantitative phenotype assessment.
- Enables side-by-side comparison of control and experimental phenotypes within the same organism.
- Reduces technical barriers for assay standardization in challenging insect models.
Translational & Preclinical Research
- Aligns gene function studies with disease-relevant developmental and pigmentation pathways.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation in evolutionary diverse systems.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by clarifying gene-phenotype relationships.
- Offers predictive de-risking for targets conserved across insect and vertebrate models.
Pipeline & Workflow Integration
This electroporation-mediated RNAi protocol integrates into the discovery continuum from early hypothesis testing to preclinical model development, particularly for non-model and ecologically relevant species.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven gene function analysis and pathway mapping in Odonata.
- Screening: Provides reproducible, quantitative readouts of gene suppression phenotypes.
- Analytics: Enables statistical comparison of pigmentation and morphogenesis outcomes across experimental conditions.
- Translational Research: Bridges functional genomics in non-model insects to broader preclinical insights.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable workflow for gene suppression in species where traditional RNAi fails.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in gene function studies.
- Operational Value: Standardizes gene suppression protocols for reproducibility and scalability in non-model organisms.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and capital efficiency by expanding tractable model systems.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of targets validated in diverse biological contexts.
Implementation Considerations
- Requires expertise in insect handling, microinjection, and electroporation techniques.
- Needs access to electroporators, microinjection apparatus, and phenotypic imaging tools.
- Demands cross-team standardization for protocol reproducibility and data comparability.
- May require adaptation for different developmental stages or insect species.
- Efficiency and phenotype variability depend on electrode placement and developmental timing.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:01
Protocol: Electroporation-mediated RNAi- In the Abdomen of Damselfly (Ischnura senegalensis)
4:21
Protocol: Electroporation-mediated RNAi- In the Thorax of Damselfly (Ischnura senegalensis)
6:54
Protocol: Electroporation-mediated RNAi- In the Abdomen of Dragonfly (Pseudothemis zonata)
10:16
Representative Results
11:51
Discussion
