التعديل الوراثي القائم على التثقيب الكهربائي للخلايا الظهارية الصبغية البشرية الأولية باستخدام نظام ترانسبوزون الجمال النائم

توضح هذه الطريقة النقل القائم على التثقيب الكهربائي للخلايا الظهارية الصبغية البشرية الأولية باستخدام نظام Sleeping Beauty Transposon ، وهو دليل على التعبير الجيني المحوري وإفراز البروتين. يتيح الجمع بين نظام Sleeping Beauty Transposon والتثقيب الكهربائي النقل الفعال للخلايا الظهارية الصبغية البشرية الأولية ، بالإضافة إلى التعبير الجيني المستقر والمستمر وإفراز البروتين. الهدف العام هو إنشاء علاج إضافة الجينات القائم على الخلايا لعلاج الأمراض التنكسية في شبكية العين ، الأمر الذي يتطلب إفرازا مستقرا ومستمرا للبروتين النشط علاجيا.

سيوضح الإجراء آن فريالدينهوفن وأنتجي شيفر ، المساعدان الفنيان الطبيان من المختبر. لتحضير الحمض النووي البلازميد للتثقيب الكهربائي لخلية RPE البشرية الأولية ، استخدم مقياس الطيف الضوئي الصغير لتحديد محتويات الحمض النووي البلازميد ، واضبط التركيز على 250 نانوجرام لكل ميكرولتر في 10 مليمولار Tris-HCL. امزج حجما واحدا من 250 نانوجراما لكل ميكرولتر من الحمض النووي البلازميد SB100X transposase مع 16 مجلدا من 250 نانوجرام لكل ميكرولتر من الحمض النووي المشتق من ظهارة الصباغ المشتق من البلازميد.

أضف اثنين ميكرولتر من خليط البلازما الناتج إلى أنبوب طرد مركزي صغير معقم بقفل آمن سعة 1.5 ملليلتر على الثلج واملأ أنبوبا عازلا بثلاثة ملليلتر من المخزن المؤقت E.ثم أدخل الأنبوب في محطة الماصة حتى تسمع نقرة واضبط جهاز النقل على 1 ، 100 فولت ، وعرض نبضة 20 مللي ثانية ونبضتين. لتحضير الخلايا للتثقيب الكهربائي. أولا ، تحقق من مورفولوجيا مزارع خلايا RPE الأولية عبر الفحص المجهري لتباين الطور لتقييم نموها والتقاءها.

عالج الخلايا ب 500 ميكرولتر من 0.05٪ Trypsin EDTA لكل بئر لمدة سبع إلى 15 دقيقة في حاضنة زراعة الخلايا. عندما تنفصل الخلايا عن طريق الطرد المركزي ، أعد تعليق الخلايا في ملليلتر واحد من PBS وأجهزة الطرد المركزي من واحد إلى 10 مرات 10 إلى حصص الخلايا الأربع لكل تفاعل نقل. أعد تعليق الكريات في 11 ميكرولترا من المخزن المؤقت R لكل أنبوب وأضف ميكرولترين من خليط البلازميد المحضر إلى كل أنبوب.

أدخل رأس ماصة النقل في طرف نقل 10 ميكرولتر حتى يلتقط المشبك جذع التثبيت للمكبس بالكامل ويقوم بتحميل الخلية ومحلول البلازميد في طرف النقل. أدخل ماصة النقل في الأنبوب العازل الموجود داخل محطة الماصة حتى تسمع نقرة واضغط على ابدأ لبدء عملية التثقيب الكهربائي. بعد النقل ، قم بإزالة ماصة النقل بعناية من محطة الماصة وعلى الفور ماصة الخلية ومحلول البلازميد في الآبار المعدة للوحة ثقافة الخلية.

لتنقية بروتينات اندماج عامل الظهارة الصبغية الموسومة من طاف زراعة الخلايا RPE. أولا ، استخدم طرفا مقطوعا مائلا لجمع حصة 30 ميكرولتر من ملاط النيكل NTA لكل عينة وحبيبات راتنج النيكل NTA عن طريق الطرد المركزي. أعد تعليق راتنج النيكل NTA بعناية مع 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت لحضانة One X وحبيبات المحلول مع طرد مركزي إضافي مرتين.

بعد الطرد المركزي الثاني ، أعد تعليق كريات راتنج النيكل NTA بعناية مع 40 ميكرولتر من مخزن الحضانة Four X لكل عينة. بعد ذلك ، امزج 55 ميكرولترا من حصة واحدة من ملاط النيكل NTA المعالج مسبقا مع 260 ميكرولترا من مخزن الحضانة Four X و 900 ميكرولتر من كل طافت ثقافة خلية RPE. احتضان الخليط على شاكر هزاز في درجة حرارة الغرفة لمدة 60 دقيقة وبيليه مخاليط راتنج النيكل NTA مرة أخرى.

أعد تعليق الكريات بعناية في 175 ميكرولتر من المخزن المؤقت لحضانة One X وطرد المخاليط مرتين أخريين. بعد الطرد المركزي الثاني ، أعد تعليق كريات راتنج النيكل NTA بعناية في 30 ميكرولتر من المخزن المؤقت للشطف لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع اهتزاز العينات وطردها بالطرد المركزي مرة أخرى. ثم اجمع الطاف بعناية واخلطها مع مخزن عينة Two X SDS لتحليل الدم الغربي للبروتينات النقية.

تظهر خلايا RPE الأولية المزروعة المعزولة من عيون المتبرع البشري مورفولوجيا مرصوفة بالحصى نموذجية بغض النظر عن عمر المتبرع أو وقت العزلة بعد الوفاة أو وقت الزراعة. تطبيق نبضات كهربائية قصيرة المدى على خلايا RPE البشرية الأولية. استخدام نظام النقل الشعري لا يؤثر سلبا على التشكل الظهاري.

يظهر تحليل الدم الغربي لطاف زراعة الخلايا البشرية الأولية RPE إفراز عامل مشتق من ظهارة الصباغ بمستويات ثابتة دون إسكات الجينات المحورة لأكثر من 500 يوم. كما لوحظ في تحليل الدم الغربي التمثيلي هذا لوسط زراعة الخلايا من عمليات النقل التي يتم إجراؤها بشكل متسلسل ، لوحظ معدل إفراز عامل مشتق من ظهارة الصباغ أعلى عالميا في 21 يوما بعد النقل. في الثقافة المتبعة ، يستمر إفراز PEDF المرتفع على المدى الطويل لمدة 165 يوما على الأقل.

بالإضافة إلى ذلك ، يكشف القياس الكمي القائم على ELISA عن زيادة بمقدار 20 ضعفا في إجمالي إفراز العامل المشتق من ظهارة الصباغ في خلايا RPE البشرية الأولية المنقولة مقارنة بخلايا التحكم غير المنقولة ذات الصلة. تم تأكيد هذه الزيادة أيضا على مستوى التعبير الجيني الذي تم عنده رفع إجمالي تعبير PEDF أكثر من 30 ضعفا. عند محاولة هذا البروتوكول ، من المهم استخدام الخلايا الظهارية الصبغية التي يتوافق مورفولوجيتها مع حالة In Vivo.

تذكر أيضا أن ترسم محلول الخلية في طرف النقل بدون فقاعات هواء. يمكن استخدام الخلايا المنقولة بثبات في نماذج مختلفة من Ex Vivo أو In vivo للتحقق من وظائف علاج إضافة الجينات القائم على الخلايا.