إعادة برمجة مباشرة من الخلايا الليفية البشرية في Myoblasts للتحقيق في العلاجات للاضطرابات العصبية العضلية

مرحباً بالجميع اسمي (نيكولاس وين). أنا محقق رئيسي في مستشفى الأطفال في كولومبوس، أوهايو.

واليوم سنعرض لك فيديو حول كيفية أخذ خزعة الجلد وتحويلها إلى myoblasts و myotube. هذه أداة مفيدة جدا لدراسة اضطراب الأعصاب والعضلية. وبالإضافة إلى ذلك، انها وسيلة أسرع التكنولوجيا مقارنة مع IPSC لأننا نستخدم نوعين مختلفين من الفيروسات لمكافحة هذا النوع من الخلايا مباشرة.

يوضح هذا الفيديو البروتوكول لإنشاء الثقافات الليفية المستمدة من الجلد البشري ، والتحويل إلى myoblasts ، ثم متمايزة myotubes. يتم نقل خزعة الجلد إلى زراعة الخلايا لاشتقاق الخلايا الليفية الجلدية. وتستخدم الفيروسات العدتين تحمل hTERT والجينات MYOD لنقل هذه الخلايا الليفية.

عند إضافة myoblast المتوسطة النمو تكملها Doxycycline، يتم التعبير عن جين MYOD، مما أدى إلى تحويل الخلايا الليفية إلى myoblasts. بعد ذلك، يتم تحويل المتوسطة إلى وسيط تمايز، وتستكمل أيضا مع دوكسيسيكلين. ثم يندمج myoblasts مع بعضها البعض ، وتشكيل ميوتيوبيد متعددة النوى.

استلهمي وسائل الإعلام من الأنبوب وشطف الخزعة بـ 10 ملليلترات ، واحدة × PBS في درجة حرارة الغرفة ، ثلاث مرات. بعد الغسيل الثالث، اترك برنامج تلفزيوني في الأنبوب. صب خارج برنامج تلفزيوني وخزعة الجلد على طبق مربع 10 سم.

باستخدام مشرط عقيم، وقطع خزعة إلى قطع صغيرة قدر الإمكان. باستخدام ماصة، نقل قطعة الجلد الفردية على طبق معقمة 10 سم مربع. التعرق الزائد من برنامج تلفزيوني من جميع أنحاء كل قطعة.

يجب الحرص على عدم الطامح قطعة نفسها. غطي الأطباق بالغطاء جزئياً واسمح للجلد بالتجفيف لمدة خمس إلى عشرين دقيقة. لا تسمح للقطع أن تجف لفترة طويلة جدا.

مرة واحدة في القطع الجافة، إمالة الطبق في زاوية 45 درجة وإضافة ببطء 12 ملليلتر من المتوسطة الليفية إلى زاوية الطبق. خفض أسفل الطبق، وتوزيع وسائل الإعلام بعناية بحيث لا يتم رفع القطع حتى من قبل وسائل الإعلام. ضع الأطباق في الحاضنة.

استبدال وسائل الإعلام في خمسة إلى سبعة أيام، ومرة واحدة في الأسبوع بعد ذلك. بذور الخلايا الليفية الأولية في 30٪ من التقاء واثنين من الآبار من 12 بئر لوحة، ما يقرب من 20،000 الخلايا في البئر، من أجل أن يكون حوالي 50٪ من التقاء في اليوم التالي. بالنسبة للتشفير العدسي، أضف 2 إلى 5 مليارات جينوم فيروسي من فيروس الهتكر بوروميسين لينتي و400 ميكرولترات من الوسط الليفي.

إضافة مزيج من فيروس العدس إلى بئر واحد. إلى البئر الثانية، إضافة فقط 400 ميكرولترات من المتوسطة الليفية. في اليوم التالي، أضف ملليلتر واحد من الوسائط.

بعد يوم أو يومين، نقل الخلايا إلى لوحة ستة بئر وتنمو حتى تصل إلى 60 إلى 70٪ التقاء. تكملة المتوسطة الليفية مع ميكروغرام واحد لكل ملليلتر من بوروميسين وإضافة ملليلترين إلى كل بئر. إبقاء الخلايا تحت الاختيار حتى جميع الخلايا في السيطرة جيدا ميتة لمدة 12 يوما على الأقل، وتغيير وسائل الإعلام كل يومين إلى ثلاثة أيام.

البذور H الرسم البياني التعبير عن الخلايا الليفية في التقاء 30٪ في ثلاثة آبار من لوحة 12 جيدا أن يكون حوالي 50٪ التقاء في اليوم التالي. بالنسبة لعملية تحويل الألياف الليفية، اخلط 2 إلى 5 مليارات جينوم فيروسي من فيروس العدن من MYOD Hygromycin B و400 ميكرولترات من وسط الخلايا الليفية وإضافة إلى بئرين. إضافة ملليلتر واحد من المتوسط في اليوم التالي.

بعد يوم أو يومين نقل الخلايا إلى لوحة ستة بئر وتنمو حتى 60 إلى 70٪ التقاء. وسائل الإعلام النمو تكملة مع 400 ميكروغرام لكل ملليلتر من Hygromycin B.Add مليلتر اثنين إلى كل بئر. إبقاء الخلايا تحت الاختيار حتى جميع الخلايا في آبار التحكم قد ماتت، وعادة ما تأخذ ما لا يقل عن 12 يوما، وتغيير وسائل الإعلام كل يومين إلى ثلاثة أيام.

لاحتياد الخلايا العضلية، تنمو الخلايا الليفية حتى تكون 70٪. إضافة ثمانية ميكروغرام لكل ملليلتر من دوكسيسيكلين إلى متوسط نمو myoblast. دائما استخدام aliquots الطازجة من دوكسيسيكلين والمتوسطة.

يجب إعداد الوسيطة مباشرة قبل أي تغيير في وسائل الإعلام. بالإضافة إلى ذلك، يجب أن لا يتم refrozen Doxycycline. التعرق المتوسطة الليفية وشطف الخلايا مع برنامج تلفزيوني.

إضافة 10 ملليلتر من وسائل الإعلام myoblast مكملة. بعد يومين إلى ثلاثة أيام، الخلايا هي 90 إلى 95٪ التقاء وسوف مورفولوجيا تغيرت. pirate وسائط النمو myoblast وشطف سطح الخلية مع برنامج تلفزيوني.

إضافة 10 ملليلتر من وسائل الإعلام التمايز التي تم استكمالها مع ثمانية ميكروغرام لكل ملليلتر من Doxycycline الطازجة. استمر في تغيير وسائل الإعلام كل يومين إلى ثلاثة أيام حتى يتم تشكيل myotubes. سبعة إلى 10 أيام بعد بدء تمايز myotube ، يجب أن تكون الخلايا متباينة تماما ، ولكن هذا يختلف من خط خلية إلى آخر.

قد تظهر الخلايا الليفية الأولى بعد خمسة أيام من ظهور قطع الجلد في الثقافة. في الصورة B، الخلايا الليفية هي التقاء وجاهزة لنقلها إلى 75 قارورة مربعة سنتيمتر لمزيد من الانتشار. من المهم تجميد العديد من قوارير الخلايا الليفية في أرقام مرور منخفضة حيث تدخل الخلايا الأساسية في الشيخوخة المتماثلة.

مرة واحدة يتم إنشاء خطوط الخلية FM لتحويل الخلايا الليفية إلى ميوتوب، يجب أن تتكاثر الخلايا الليفية حتى 70٪ التقاء كما هو مبين في الصورة A.It من المهم ألا تتجاوز 80٪ التقاء، كما كثافة عالية قد تضعف التمايز. بعد إضافة دوكسيسكلين إلى المتوسط، في غضون يومين إلى أربعة أيام الخلايا تصبح myoblasts، تتميز مورفولوجيا ممدود والتوجه الموازي كما رأينا في صورة B.Differentiated myotubes تظهر في صورة C.The الوقت للاندماج والتمايز من myotube قد تختلف من سبعة إلى 21 يوما اعتمادا على الخلايا النمط الجيني. يجب أن يتم تجميع الخلايا أو إصلاحها قبل أن تنفصل.

يمكن ملاحظة بداية المفرزة حسب اللون والسطوع لحافات اليوتوب ، كما أشارت الأسهم في هذه الصورة. من خلال الفلوروسين المناعي ، يؤكد التعبير عن بروتينات العضلات الناضجة المحددة التحويل الناجح للخلايا الليفية إلى ميوتوب. في هذه الصور، تظهر ثلاث خلايا مختلفة.

درجة التمايز تختلف من خلية إلى خلية، ويمكن أو لا يمكن أن تتأثر بالطفرة الأولية كما هو الحال من الخلايا في الأرقام B و C.مزيد من التحقق من النموذج تم تأكيدها من قبل RNAseq. كما هو مبين في هذه المؤامرة هناك أكثر من 12،000 الجينات التي أعرب عنها بشكل تفاضلي الكشف عنها في ميوتوب FM مقارنة مع تلك التي من الهيكل العظمي. الارتباط الكبير بين كلا transcriptomes يدعم أن خلايا FM لديها صورة تعبير محددة العضلات مما يدل على أنها بديل مفيدة وموثوق بها لخطوط الخلايا المشتقة من العضلات.

لتوضيح فائدة هذا النموذج في المختبر، استخدمنا واحدة من الازدواجية إكسرونيك الأكثر شيوعا في الجين DMD. ازدواجية إكسون اثنين يؤدي إلى تعطيل إطار القراءة DMD، وتخطي لها يمكن أن يؤدي إما إلى استعادة هذا الإطار القراءة أو الاستفادة من موقع دخول الريبوسوم الداخلية. وقد تم بالفعل التحقق من صحة هذا العلاج مع في دراسات الجسم الحي الشكل ألف، أظهرنا دليلا على مفهوم من قبل تحليل RTPCR من هذا الخط خلية متحولة خاصة، مع وبدون العلاج عن طريق تخطي exon.

لطخة الغربية في الشكل B يوضح أن يتم التعبير عن بروتين دايستروفين الوظيفية في الخلايا المعالجة. عند مقارنة كفاءة هذا العلاج إلى نماذج في الجسم الحي، النتائج دعم موثوقية تقنية تمايز الخلية ودعم استخدامها لاختبار مختلف العلاجات الجينية الطفرة محددة. قبل الدراسات السريرية اللازمة لاختبار فعالية الدعم العلاجي الرسمي على الاضطرابات العصبية العضلية، اعتمادا على قدرة النماذج الحيوانية والخلوية.

تطوير نماذج حيوانية، على الرغم من كونها أسهل في الوقت الحاضر، لا خيار ممكن لكل طفرة محددة. إن توليد الخلايا العضلية من خلال خلايا IPS المستمدة من الخلايا الليفية الجلدية هو بديل ، ولكنها تقنية تستغرق وقتًا طويلاً. وهكذا، هذا الإجراء هو بديل بسيط لتوليد IPS التي تسمح للتحويل المباشر من الخلايا الليفية إلى الخلايا العضلية.

أنه يسهل الوصول إلى نماذج الخلايا البشرية عن طريق تجنب تطبيق أكثر الغازية من خزعات العضلات في الختام، وهذا التحويل المباشر من الخلايا الليفية إلى myoblasts هو أداة قوية لاختبار العلاجات لاضطرابات العضلات العصبية في سياق محدد الحد.