CRISPR/Cas9 تحرير الجين C. elegans rbm-3.2 باستخدام علامة فحص dpy-10 Co-CRISPR ومجمعات ريبونوكليوبروتين المجمعة.

هذه التقنية مفيدة لإدخال طفرات دقيقة في C.elegans عن طريق تحرير الجينوم CRISPR / Cas9 في إطار زمني قصير. توفر هذه التقنية طريقة فعالة ومبسطة لتحرير جينوم C.elegans ، حيث أن استخدام علامة Co-CRISPR يحسن بشكل كبير من احتمالية تحديد الديدان المعدلة بشكل إيجابي. تأكد من ممارسة إجراء الحقن المجهري ، وحقن ذراعي الغدد التناسلية لأكبر عدد ممكن من الديدان لزيادة فرص الحصول على التعديلات المطلوبة.

ستظهر الإجراء إيمي سميث وماري بيرجويل ودانيتا ماثيو وإيلي سميث وكارتر ديرلام ، وجميعهم طلاب جامعيون من مختبري. لتحضير الديدان الصغيرة للحقن ، اختر L2 ، L3 المرحلة C.elegans في عشب بكتيري جديد على طبق MYOB واحتضان اللوحة عند 20 درجة مئوية طوال الليل. في صباح اليوم التالي، قم بإعداد مزيج الحقن كما هو موضح في الجدول في أنابيب معقمة خالية من النوكلياز واخلطها عن طريق سحب العينات.

احتضان مزيج الحقن عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة لتجميع مجمعات البروتين النووي الريبي قبل تدوير المزيج عن طريق الطرد المركزي. بعد ذلك ، استخدم مجهر تشريح لاختيار حوالي 30 دودة بالغة صغيرة مع أقل من 10 أجنة في الرحم ، وحقن ذراعي الغدد التناسلية لكل دودة ببضعة بيكوليتر من مزيج الحقن لكل ذراع. بعد الحقن المجهري، استخدم جهاز استرداد لفم الماصة المحقونة برفق من وسادة الحقن على صفيحة MYOB مقاس 60 ملم ومزودة بالإشريكية القولونية OP50.

اسمح للديدان المحقونة بالتعافي لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. في نهاية فترة التعافي ، استخدم معول سلك بلاتيني لنقل كل دودة محقونة إلى صفيحة أجار MYOB واحدة بذرة 35 ملم ، واسمح للديدان بوضع البيض عند 20 درجة مئوية. بعد 24 ساعة ، انقل الديدان المحقونة إلى ألواح فردية جديدة مقاس 35 ملم.

لمدة ثلاثة إلى أربعة أيام بعد الحقن ، استخدم مجهر تشريح لتحديد الصفائح التي تحتوي على ذرية F1 تظهر أنماطا ظاهرية أسطوانية ، كما يتضح من جسم الذي يدور حول محوره الطويل أثناء تحرك في نمط دائري ، والأنماط الظاهرية المغمورة ، كما يتضح من فسيولوجيا أقصر وأقوى مقارنة بالحيوانات الضابطة في نفس مرحلة النمو. انقل 50 إلى 100 دودة دوارة F1 إلى أطباقها الفردية واترك الديدان تضع البيض لمدة يوم إلى يومين. بعد يوم إلى يومين من إنتاج دودة F2 ، قم بنقل كل أم أسطوانية F1 واحدة من لوحة مرقمة إلى أنبوب PCR المرقم المقابل الذي يحتوي على 2.5 ميكرولتر من محلول التحلل المكمل بتخفيف 1: 100 بمقدار 20 ملليغرام لكل مليلتر من البروتيناز K. قم بتجميد الأنابيب عند 30 درجة مئوية تحت الصفر لمدة 20 دقيقة قبل تحلل الديدان في مليتر حراري ، كما هو موضح.

في نهاية الدورة ، أضف 12.5 ميكرولتر من مزيج 2X PCR الذي يحتوي على ثلاثي فوسفات ديوكسي نوكليوزيد ، وبوليميراز الحمض النووي ، وكلوريد المغنيسيوم ، وصبغة التحميل ، وميكرولتر واحد من 10 ميكرومولار برايمر أمامي ، وميكرولتر واحد من 10 ميكرومولار التمهيدي العكسي ، وكمية كافية من الماء المعقم لجلب خليط التفاعل إلى 25 ميكرولتر لكل عينة من الدودة المحللة. ثم قم بتشغيل العينات على جهاز التدوير الحراري كما هو موضح. للفحص بحثا عن تعديلات يقل طولها عن 50 زوجا أساسيا ، انقل 10 ميكرولترات من كل تفاعل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل إلى أنبوب جديد وأضف خمسة ميكرولترات من مزيج هضم التقييد الرئيسي إلى كل أنبوب.

احتضان تفاعلات الهضم عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين. في نهاية الحضانة ، قم بتسخين وتنشيط عملية الهضم بحضانة لمدة 10 إلى 15 دقيقة عند 65 درجة مئوية. ثم قم بتحميل التفاعل بالكامل من كل أنبوب في بئر واحد من 1٪ إلى 2٪ من هلام الاغاروز وقم بتشغيل الجل عند 110 مللي أمبير حتى يتم تحقيق فصل النطاق المناسب.

في نهاية الجري ، تصور المواد الهلامية الاغاروز تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية للكشف عن أحجام نطاق الحمض النووي. ستعرض الديدان المعدلة إيجابيا نطاقا إضافيا من الحمض النووي بالحجم المتوقع بسبب التحرير باستخدام قالب الإصلاح ، وحمل موقع التقييد في الموضع المطلوب داخل جينوم الدودة. اختر ثمانية إلى 12 ديدة F2 غير متدحرجة من النوع البري من ألواح الدودة الأسطوانية F1 المعدلة بشكل إيجابي واسمح للديدان بوضع البيض وإنتاج ذرية لمدة يوم إلى يومين.

ثم حدد الخطوط الدودية متماثلة اللواقح كما هو موضح للديدان التي تم تحريرها إيجابيا وقم بتحليل نتائج التسلسل باستخدام برنامج تحليل التسلسل لتأكيد وجود التحرير وفقا للبروتوكولات القياسية. هنا ، يمكن ملاحظة الحمض النووي الجيني والحمض النووي الريبي CRISPR المصمم وقالب الإصلاح لجين C.elegans rbm-3.2. في هذا التحليل التمثيلي ، وجد أن سبعة من أصل 73 ديدان F1 إيجابية للتعديل.

عرضت الديدان غير المعدلة جزء الحمض النووي الفردي المكون من 445 زوجا أساسيا عند هضم EcoRI ، بينما أظهرت الديدان التي تحمل كودون توقف سابق لأوانه في جين rbm-3.2 جزأين عند 265 و 166 زوجا أساسيا عند هضم EcoRI. عرضت الديدان المعدلة غير متجانسة الزيجوت ثلاثة شظايا عند هضم EcoRI. تم العثور على ستة من أصل 12 ديدان F2 من الزيجوت F1 الإيجابية المحددة متماثلة الزيجوت لتحرير الاهتمام.

يمكن بعد ذلك استخدام الحمض النووي الجيني لخط دودة معدلة متماثلة الزيجوت محدد لإعداد تفاعل تسلسل الحمض النووي ، والذي أكد وجود التعديل في حالته متماثلة اللواقح. احرص على تصميم كواشف التحرير ومواد الفحص الأولية بشكل صحيح ، وأن مزيج الحقن قد تم تحضيره بشكل صحيح. الحقن المجهري الدقيق أمر بالغ الأهمية أيضا.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء التحقق من صحة النمط الظاهري للتعديل ، إن أمكن ، وتحليل التعبير الجيني والبروتيني للتحقق من دقة تحرير الجينوم.