تحديد شبه كمي لكثافة الخلايا العصبية الدوبامين في Substantia Nigra من نماذج القوارض باستخدام تحليل الصورة الآلي
فبراير 2, 2021
هنا نقدم طريقة آلية لتحديد شبه كمي لعدد الخلايا العصبية الدوبامين في الجرذ substantia nigra pars compacta.
تقدير عدد الخلايا العصبية الدوبامين في نيجرا substantia هو مقياس النتيجة الرئيسية في أبحاث مرض باركنسون. هذا البروتوكول يقلل بشكل كبير من عبء العمل المطلوب لتقدير عدد الخلايا العصبية. توفر هذه الطريقة عملية فعالة ودقيقة من حيث الوقت للكشف عن التغيرات في عدد الخلايا العصبية الدوبامين ومناسبة لتحديد تأثير التدخلات على بقاء الخلية.
ويمكن تكييف هذه الطريقة بسهولة لتوفير عدد دقيق من الخلايا العصبية في مناطق الدماغ المختلفة مع الحفاظ على مزايا التكلفة والوقت على الطرق التقليدية stereological. لالتقاط صور IHC استخدام البرنامج إلى جانب المجهر confocal في التكبير 10X. افتح ثقب الدبوس إلى 1.5 وحدة منطقة لالتقاط طائرة واسعة يبلغ مجموعها 1.5 متر صغير وتعيين التركيز على الجانب المحقون من الدماغ.
في علامة التبويب اكتساب تحقق من خيار التصوير مسح البلاط وتعيين الأبعاد إلى 10 في أربعة. ضمن لوحة وضع الاستحواذ تعيين التكبير إلى 1.1 لتجنب أي علامات خياطة بين الصور مسح البلاط. تعيين حجم الإطار إلى 1024 من قبل 1024 بكسل ومتوسط إلى اثنين لضمان الحصول على صورة عالية الجودة.
في لوحة القنوات تعيين المسار الأول إلى اليكسا 488 وتتبع اثنين إلى اليكسا 555. تحميل الشريحة على خشبة المسرح واختيار قسم مع تلطيخ TH قوية. انقر على الهواء مباشرة على لوحة الاستحواذ.
في لوحة القنوات تعيين قوة الليزر والحصول على المستويات التي تزيد من إشارة والحد من الضوضاء الخلفية. استخدم مؤشر النطاق لضمان عدم تعريض الإشارات بشكل مفرط. كرر ذلك باستخدام شرائح متعددة.
في علامة التبويب الاستحواذ حدد خانة الاختيار المواضع. لبدء التصوير، استخدم قطعة العين واختر القسم الأول الذي يظهر تلطيخ TH الإيجابي. ثم تعيين التركيز في نقطة الاهتمام ونقل المرحلة إلى خط الوسط من المقطع.
وهذا يحفظ الموضع في محاور X و Y و Z وسيتم تصوير مسح تجانب التقاط المقطع بأكمله. كرر ذلك لجميع الشرائح الأخرى بما في ذلك موقع غير المحقون. ملفات صور منفصلة باستخدام البرامج المناسبة واستيرادها إلى برنامج تحليل الصور الآلي.
تحديد منطقة الاهتمام عن طريق تحديد أداة التعليق القلم لرسم تعليق توضيحي حول substantia nigra pars compacta. الانتقال إلى علامة التبويب تحليل وحدد ضبط الوقت الحقيقي من القائمة المنسدلة تحليل. يفتح هذا إطار منفصل على صورة المقطع مما يسمح بتعديل معلمات التحليل في الوقت الفعلي.
ضمن قسم تكبير التحليل حدد تكبير الصورة المناسب. تحت قسم الكشف عن الخلية حدد الصبغة النووية كصبغة تستخدم لتلطيخ TH. ضبط عتبة التباين النووي، والحد الأدنى من الكثافة النووية، وعدوانية التقسيم النووي وإعدادات الحجم النووي مع مراقبة نافذة ضبط الوقت بعناية.
كرر هذه العملية مع عينات متعددة. بمجرد أخذ عينات من عدد مناسب من الصور وتعديل الضبط في الوقت الفعلي وفقا لذلك حفظ إعدادات التحليل في القائمة المنسدلة إجراءات الإعدادات. حدد جميع الصور التي سيتم تحليلها وانقر على تحليل.
اختر إعداد التحليل الذي تم حفظه للتو وفي منطقة نافذة التحليل تحقق من مربع طبقات التعليقات التوضيحية ، ثم تحقق من الطبقة الأولى وانقر على التحليل. بمجرد الانتهاء من تصدير بيانات التحليل الموجز لجميع المقاطع عن طريق تحديد خيار تصدير بيانات تحليل الكائن. يمكن استخدام مجموعة البيانات هذه لفحص التغيرات في حجم الخلية استجابة للسموم أو العلاجية.
بعد ستة أسابيع من حقن الفيروس المرتبطة أدينو أو AAV، أدى الحقن المجسمة من AAV التعبير عن متحولة A53T ألفا سينوكلين في نيجرا substantia في دماغ الفئران في انخفاض كبير في كثافة الخلايا العصبية الدوبامين. انخفض متوسط عدد الخلايا العصبية الإيجابية TH لكل ملليمتر مربع في نيغرا substantia من الفئران التي تم حقنها مع AAV-A35T بشكل كبير بالمقارنة مع الفئران التي تم حقنها مع ناقلات فارغة AAV. وقدمت ملاحظات مماثلة باستخدام مجسمة غير متحيزة.
عند محاولة هذا البروتوكول نضع في اعتبارنا البرنامج هو فقط مفيدة كما هو مدرب على أن يكون. لذلك يجب أخذ الوقت والعناية لضمان تحديد خلية واحدة كخلية واحدة. يمكن تكييف البرنامج لقياس كثافة الفلورسينس من البروتينات الأخرى ذات الاهتمامات مثل ألفا سينوكلين لتحديد ما إذا كانت العلاجات يمكن أن تعدل مستويات البروتين.
وقد سمحت هذه التقنية لمزيد من الكفاءة عند اختبار تأثير العلاجات المحتملة متعددة على كثافة الخلايا العصبية الدوبامين.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تقدُّم هذه الدراسة طريقة آلية لتحديد كمّي شبه كمّي لأعداد الخلايا العصبية الدوبامينية في الجزء المضغوط من المادة السوداء لدى الفئران. يقلل البروتوكول بشكل كبير من عبء العمل ويزيد من الدقة عند تقدير عدد الخلايا العصبية، وهو أمر حاسم في بحوث مرض باركنسون.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- علم النفس
- بيولوجيا الخلية
الخلفية
- تقدير أعداد الخلايا العصبية الدوبامينية حيوي لأبحاث مرض باركنسون.
- الطرق التقليدية قد تكون متعبة وتنقصها الدقة.
- الطرق الآلية يمكن أن توفر كفاءة زمنية ومزايا اقتصادية.
- التغييرات الكمية في أعداد الخلايا العصبية يمكن أن تقيّم التأثيرات العلاجية.
هدف الدراسة
- تقديم طريقة لكشف أعداد الخلايا العصبية الدوبامينية بكفاءة ودقة.
- تمكين الباحثين من تحليل التغيرات في عدد الخلايا العصبية بسبب تدخلات مختلفة.
- تبسيط عملية التصوير وتحليل البيانات للخلايا العصبية الدوبامينية.
الطرق المستخدمة
- طريقة التصوير الآلية باستخدام الميكروسكوب الليزري الماسح.
- التركيز على الجزء المضغوط من المادة السوداء في نموذج الجرذ.
- يتضمن البروتوكول التقاط صور الـ IHC بتكبير 10X مع إعدادات تصوير محددة.
- ضبط وتحليل الصور العصبية في الوقت الحقيقي عبر برامج آلية.
- شمل تحليل البيانات للتغيرات في كثافة الخلايا العصبية بعد التدخل.
النتائج الرئيسية
- أظهرت هذه الطريقة تخفيضات هامة في كثافة الخلايا العصبية الإيجابية لـ TH بعد حقن AAV التي تعبر عن ألفا سينوكلئين A53T الطافر.
- أشارت النتائج إلى انخفاض في عدد الخلايا العصبية الدوبامينية مقارنة بمجموعات التحكم.
- استخدمت الاستيرولوجيا غير المتحيزة للتحقق من النتائج.
- تمكن من كشف التغيرات المورفولوجية استجابة للتدخلات العلاجية.
الاستنتاجات
- تؤكد الدراسة طريقة فعالة لتحديد الخلايا العصبية الدوبامينية.
- تعزز هذه التقنية فهم فقدان الخلايا العصبية في نماذج مرض باركنسون.
- يمكن أن تسهّل الطرق المقدمة استكشاف التأثيرات العلاجية على كثافة الخلايا العصبية.
الأسئلة المتكررة
Executive Industry Relevance
Accurate quantification of dopaminergic neuron density in the substantia nigra is critical for preclinical Parkinson's disease research and therapeutic evaluation. Automated image analysis offers a scalable, time-efficient alternative to traditional stereology, enabling rapid assessment of neuroprotective interventions. This approach supports robust target validation and accelerates decision-making at key discovery inflection points.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative assessment of neuronal loss or protection in disease-relevant models.
- Supports functional validation of therapeutic targets by measuring intervention effects on cell survival.
- Facilitates mechanistic de-risking by providing objective, reproducible neuron counts.
Screening & Assay Development
- Prepares validated brain region assays for compound screening workflows.
- Standardizes neuron quantification, improving reproducibility and assay comparability.
- Delivers quantitative outputs suitable for high-throughput evaluation of multiple interventions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns preclinical readouts with disease-relevant endpoints for translational continuity.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on robust neuronal survival data.
- Supports biomarker development by quantifying protein expression changes alongside neuron counts.
Pipeline & Workflow Integration
This automated quantification method integrates from early discovery through preclinical validation, bridging target validation, screening, and translational research phases.
- Discovery Biology: Provides objective neuron density measurements for hypothesis testing and pathway analysis.
- Screening: Offers reproducible, scalable quantification for compound evaluation and assay development.
- Analytics: Generates exportable datasets for statistical comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Maintains continuity of disease-relevant endpoints across the pipeline.
- Enterprise Reuse: Adaptable to other brain regions and protein markers, supporting broad R&D applications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neurodegeneration studies.
- Operational Value: Streamlines workflows with automation, improving throughput and reproducibility.
- Strategic Value: Enables faster go/no-go decisions and more efficient resource allocation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of therapeutic candidates based on robust quantitative data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in confocal imaging and image analysis parameter optimization.
- Needs access to compatible microscopy and automated analysis software infrastructure.
- Demands careful cross-team standardization of imaging and analysis protocols.
- Adaptable across different brain regions and protein targets with appropriate validation.
- Accuracy depends on rigorous training and tuning of analysis software for single-cell identification.
