تصور سارس-CoV-2 باستخدام الحمض النووي الريبي المناعي-فلورسينس في التهجين في الموقع
ديسمبر 23, 2020
هنا، ونحن نصف طريقة بسيطة تجمع بين مضان الحمض النووي الريبي في التهجين الموقعي (RNA-FISH) مع immunofluorescence لتصور الفيروس التاجي متلازمة الجهاز التنفسي الحاد الوخيمة 2 (سارس-CoV-2) الجيش الملكي النيبالي. وقد يزيد هذا البروتوكول من فهم الخصائص الجزيئية للتفاعلات بين سارس وكاف-2 التي تستضيف الحمض النووي الريبي على مستوى الخلية الواحدة.
أتاح هذا البروتوكول تصور الحمض النووي الريبي SARS-CoV-2 في خطوط الخلايا وفي مزارع ظهارة مجرى الهواء البشري ثلاثية الأبعاد المتمايزة تماما ، مما يوفر أداة لفهم التسبب الفيروسي والتكاثر بشكل أفضل على مستوى الخلية الواحدة. نظرا لخصوصيتها العالية وحساسيتها ودقتها ، فإن هذه الطريقة مفيدة ليس فقط لدراسات العلوم الأساسية ل SARS-coronavirus-2 ولكن أيضا للمشاريع التطبيقية ، مثل التشخيص. ستظهر الإجراء أغنيسكا سودر ، طالبة دكتوراه من مختبري.
بعد تثبيت الخلايا وتنفذها كما هو موضح في المخطوطة النصية ، قم بإزالة محلول 1X PBS من الآبار ، وأضف ما لا يقل عن 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتضخيم إلى كل بئر. احتضان العينات لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. قم بإعداد كل دبوس شعر HCR عن طريق تبريد الحجم المطلوب في أنابيب منفصلة.
لتحضير 300 ميكرولتر من محلول التضخيم ، استخدم 18 بيكومول من كل دبوس شعر. انقل محلول دبوس الشعر إلى أنابيب ، واحتضنها عند 95 درجة مئوية لمدة 90 ثانية. ثم تبرد إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة في الظلام.
قم بإعداد خليط دبوس الشعر عن طريق إضافة دبابيس الشعر H1 و H2 المبردة بشكل سريع إلى المخزن المؤقت للتضخيم. ضع قطرات من 30 إلى 50 ميكرولترا من خليط دبوس الشعر على بارافيلم ضع الغطاء مع الخلايا على قطرات خليط دبوس الشعر ، واحتضن العينات طوال الليل في الظلام في درجة حرارة الغرفة.
لتركيب الشرائح ، ضع قطرتين سعة 10 ميكرولتر من وسط التثبيت على شريحة ، مع التأكد من فصل القطرات بشكل كاف للسماح بوضع غطاءين على شريحة واحدة. قم بإزالة السوائل الزائدة عن طريق النقر على أغطية منشفة نظيفة. ثم ضعها في وسط تركيب مضاد للبهتان بحيث تكون الخلايا متجهة لأسفل.
ضع العينات المركبة على سطح جاف ومستو في الظلام ، واتركها تشفي. بعد تثبيت خلايا الوذمة الوعائية الوراثية وتنفذها كما هو موضح في المخطوطة النصية ، قم بتضخيم العينات مسبقا عن طريق احتضانها بمخزن مؤقت للتضخيم لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. استخدم 30 بيكومول من كل دبوس شعر لتحضير 500 ميكرولتر من محلول التضخيم.
انقل محلول دبوس الشعر إلى الأنابيب ، واحتضنها عند 95 درجة مئوية لمدة 90 ثانية. ثم قم بتبريدها إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة في الظلام. قم بإعداد محلول دبوس الشعر عن طريق إضافة جميع دبابيس الشعر المبردة إلى 500 ميكرولتر من مخزن التضخيم في درجة حرارة الغرفة.
قم بإزالة محلول التضخيم المسبق ، وأضف محلول دبوس الشعر الكامل. ثم احتضان العينات طوال الليل في درجة حرارة الغرفة في الظلام. ضع الغشاء المقطوع من إدخالات Transwell على 10 ميكرولتر من وسط التثبيت المضاد للبهتان بحيث تكون الخلايا متجهة لأعلى ، وأضف وسيطا إضافيا للتركيب إلى الغشاء.
ثم قم بتغطية الأغشية بأغطية. تم تنفيذ بروتوكول RNA-FISH المناعي هذا في نظامين خلويين ، خط خلية Vero وثقافة ظهارة مجرى الهواء البشري ثلاثية الأبعاد. يظهر هنا توطين الحمض النووي الريبي الفرعي الجيني SARS-coronavirus-2 في خلايا Vero المصابة والملقحة بشكل وهمي.
يمكن رؤية الحمض النووي الريبي الفيروسي باللون الأحمر. يظهر هنا توطين الحمض النووي الريبي الفرعي الجيني SARS-coronavirus-2 في الخلايا الظهارية لمجرى الهواء البشري المصابة والملقحة بشكل وهمي. تم تحسين بروتوكول النفاذية في خلايا Vero.
ينتجعن النفاذية مع المنظفات إشارة واضحة ومحددة للحمض النووي الريبي الفرعي SARS-coronavirus-2 ، بينما ينتج عن استخدام الإيثانول صورة ضبابية وغير مركزة. عند تركيب الشرائح بخلايا Vero ، من المهم وضع غطاء بحيث تكون الخلايا متجهة لأسفل. عند تركيب شرائح الوذمة الوعائية الوعائية ، يجب وضع الغشاء مع توجيه الخلايا لأعلى.
يمكن تعديل هذه التقنية بسهولة لتمكين اكتشاف أي RNA ، بما في ذلك الحمض النووي الريبي غير المشفر وفيروسات الحمض النووي الريبي التي قد تظهر في المستقبل. إلى جانب التألق المناعي ، يمكن استخدامه لدراسة تفاعلات البروتين والحمض النووي الريبي على مستوى الخلية الواحدة.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة طريقة تدمج تهجين الحمض النووي الريبي الفلوريسنت في الموقع (RNA-FISH) مع المناعة الفلوريسنت لتصور الحمض النووي الريبي SARS-CoV-2. يعزز هذا النهج فهم تفاعلات الحمض النووي الريبي SARS-CoV-2 مع المضيف على مستوى الخلية الواحدة.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- علم الفيروسات
- علم الأحياء الخلوية
الخلفية
- فهم التسبب الفيروسي ضروري لتطوير تشخيصات وعلاجات فعالة.
- لـ SARS-CoV-2 آثار مهمة على الصحة العامة.
- تصور الحمض النووي الريبي على مستوى الخلية الواحدة يمكن أن يوفر رؤى حول التكاثر الفيروسي.
- يوفر الجمع بين RNA-FISH والمناعة الفلوريسنت خصوصية وحساسية عالية.
هدف الدراسة
- لتصور الحمض النووي الريبي SARS-CoV-2 في نماذج خلوية مختلفة.
- لتعزيز فهم التفاعلات الفيروسية داخل الخلايا المضيفة.
- لتوفير أداة لكل من البحث الأساسي والتطبيقي في علم الفيروسات.
الطرق المستخدمة
- تثبيت الخلايا وجعلها قابلة للاختراق.
- استخدام عازلة تضخيم لتصور الحمض النووي الريبي.
- استخدام حلقات HCR للكشف المحدد عن الحمض النووي الريبي.
- تقنيات المناعة الفلوريسنت لتكملة RNA-FISH.
النتائج الرئيسية
- تم التصور بنجاح الحمض النووي الريبي SARS-CoV-2 في خطوط الخلايا وثقافات ظهارة مجرى الهواء البشري.
- أظهرت الطريقة خصوصية وحساسية عالية.
- تساهم النتائج في فهم أفضل للتسبب الفيروسي.
- يمكن تطبيق هذا البروتوكول لأغراض البحث والتشخيص.
الاستنتاجات
- الطريقة المدمجة فعالة لدراسة SARS-CoV-2 على مستوى الخلية الواحدة.
- توفر رؤى قيّمة حول تفاعلات الحمض النووي الريبي مع المضيف.
- يمكن لهذا النهج المساعدة في تطوير أدوات تشخيصية.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
High-resolution visualization of SARS-CoV-2 RNA in both cell lines and 3D human airway epithelium cultures enables precise mapping of viral replication and host-pathogen interactions at the single-cell level. This capability supports mechanistic de-risking and target validation in infectious disease research pipelines. The protocol's adaptability for diverse RNA targets positions it as a reusable asset for rapid response to emerging viral threats.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of viral replication and localization in physiologically relevant systems.
- Supports functional validation of host-virus interaction targets at single-cell resolution.
- Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing specific infection events from background.
- Provides high-confidence data for triaging antiviral targets and pathways.
Screening & Assay Development
- Delivers validated, quantitative readouts for viral RNA detection in cell-based assays.
- Supports assay standardization and reproducibility across cell lines and 3D cultures.
- Enables multiplexed detection of RNA and protein targets for comprehensive screening.
- Prepares robust biological systems for downstream compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant airway models for translational continuity.
- Enables mapping of infection and host response in preclinical tissue systems.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by providing predictive, single-cell data.
- Facilitates biomarker discovery through simultaneous RNA and protein visualization.
Pipeline & Workflow Integration
This immuno-RNA-FISH protocol integrates from early discovery through preclinical research, supporting hypothesis testing, target validation, and translational biomarker alignment.
- Discovery Biology: Provides high-specificity detection of viral RNA for pathway clarification and biological de-risking.
- Screening: Offers reproducible, quantitative outputs for assay development and compound screening.
- Analytics: Enables single-cell resolution measurements and multiplexed readouts for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges in vitro and ex vivo models for preclinical validation of infection and host response.
- Enterprise Reuse: Adaptable for detection of any RNA, supporting rapid deployment against emerging pathogens.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in viral pathogenesis studies.
- Operational Value: Standardizes sensitive, multiplexed detection workflows across diverse biological models.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust target validation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of antiviral programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in advanced fluorescence microscopy and in situ hybridization techniques.
- Needs access to confocal imaging platforms and validated amplification reagents.
- Demands cross-team standardization for reproducibility across cell and tissue models.
- Adaptable to various RNA targets with protocol optimization for new systems.
- Dependent on careful permeabilization and mounting to ensure signal specificity and clarity.
![تصوير [كنفوكل] الحمض النووي الريبي مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل ونمط الاعتراف مستقبلات في الإصابة بفيروسات الرنا الشعور السلبي](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F59095.jpg%3Fv%3D2026-07-04T06%253A27%253A38.000Z&w=384&q=75)
