العزلة والتصوير الفاصل الزمني لخلايا ميسنشيم الجنينية للفأر الأولي لتحليل سمات الحركة الجماعية

يسمح هذا البروتوكول للمحققين في مجال القحف الوجهي بمقارنة سمات الحركة الجماعية في التحكم والخلايا المتحولة كميا كوسيلة لفهم إعادة عرض الزوايا المتوسطة أثناء ارتفاع الجرف الحنكي. إن استخدام الخلايا المتوسطة الجنينية الأولية للفأر والتصوير الفاصل الزمني يوفران طريقة وكيلة يمكن الوصول إليها لتقييم ديناميكيات ارتفاع الجرف الحنكي. لحصاد الأصداف الفخمة من جنين فأر، استخدم ملعقة مثقبة معقمة لوضع جنين اليوم الجنيني 13.5 في طبق معقم طوله 10 سنتيمترات مليء بوسط ثقافة MEPM معقم تحت مجهر ستيريو.

بعد قطع الرأس، أدخل طرف واحد من ملقط No.5 غرامة معقمة في الفم فقط داخل الخد ودفع غيض من ملقط حتى يخرج الجزء الخلفي من الجمجمة. توجيه ملقط بحيث الذراع الأخرى تحوم فقط فوق قناة الأذن قبل معسر ملقط مغلقة لقطع الأنسجة. كرر الشق على الجانب الآخر من الرأس، ومواصلة إجراء قطع قرصة حتى الفك السفلي، اللسان، وجزء أدنى من الجمجمة قد أزيلت، وفضح الرفوف الفخمة.

مع وضع الرأس على جانبه ، ضع نصائح زوج من مقص صغير معقم من الفولاذ المقاوم للصدأ أمام الجمجمة وخلفها فقط حول مستوى عين الجنين وقطع فوق العينين لإزالة الجمجمة ، مما يخلق سطحا مسطحا. بعد ذلك، وضع الرأس رأسا على عقب مع الجانب متفوقة يستريح شقة في الجزء السفلي من الطبق وتحديد موقع الرفوف الفخمة، والتي ينبغي أن تكون مرئية كما جسرين مرتفعة على جانبي الأخدود المركزي في النصف الأمامي من الرأس. لتأمين الرأس إلى الطبق، أدخل طرف واحد من ملقط ناعم من خلال الأنسجة بالقرب من منطقة الأنف من الأمامي الرأس إلى الرفوف الفخمة، والآخر من خلال قاعدة الجمجمة الخلفي إلى الرفوف الفخمة.

إدراج كل نقطة من زوج ثان من حاد جدا، ملقط ناعم في الأنسجة في قاعدة السطح الجانبي للجرف وببطء وبعناية قرصة لقطع الأنسجة. كرر الشق على طول قاعدة السطح المتوسط للرف وعند كل من الطرفين الأمامي والخلفي للرف لفصل الرف عن تعلقه بالرأس ، ثم رفع الرف بلطف ، مما يجعل قرصات إضافية حسب الضرورة لتحرير القشرة تماما من الأنسجة المحيطة. عندما تمت إزالة الرف الفخم الثاني بنفس الطريقة، استخدم ماصة نقل لمبة بلاستيكية معقمة لنقل الرفوف إلى أنبوب طرد ميكرولتر معقم 1.5 ملليلتر في ما يقرب من 500 ميكرولتر من PBS على الجليد.

لإعداد ثقافة الخلية MEPM، عندما تم جمع جميع الرفوف، يستنشق برنامج تلفزيوني دون إزعاج الأنسجة وإضافة فورا 200 ميكرولتر من 37 درجة مئوية 0.25٪ تريبسين إلى كل أنبوب من الأنسجة الجرف الحنكي. استخدام ماصة 1000 ميكرولتر لمواصة لفترة وجيزة الأنسجة عدة مرات واحتضان الأنسجة لمدة 10 دقائق في 37 درجة مئوية، pipetting لفترة وجيزة بعد خمس دقائق. في نهاية الحضانة، ماصة الأنسجة مرة أخرى قبل إضافة 800 ميكرولتر من MEPM ثقافة المتوسطة إلى كل أنبوب والطرد المركزي الأنابيب لجمع الخلايا.

بعد أسبيراتينغ العملاقة، resuspend الكريات في ملليلتر واحد من المتوسطة ثقافة MEPM الطازجة لكل أنبوب، ولوح الخلايا في آبار فردية من لوحة ستة آبار الأنسجة المعالجة بالثقافة تحتوي على اثنين من ملليلتر لكل بئر إلى المجموع النهائي من ثلاثة ملليلتر لكل بئر، ثم السماح للخلايا على الالتزام السطح البلاستيكي لمدة 12 ساعة في حاضنة ثقافة الخلية العقيمة. لإعداد اختبار الهجرة الجماعية 2D، وإزالة الجزء العلوي من واحد عقيمة اثنين من جيدا إدراج السيليكون إلى ارتفاع ما يقرب من ملليمتر واحد لكل عينة لتحليلها واستخدام ملقط معقمة لوحة تقصير، عقيمة إدراج بئرين في وسط الآبار الفردية من لوحة من ستة آبار. اضغط لأسفل على طول جميع الحواف لضمان الالتزام الكامل بإدراج قيعان الآبار وخلايا MEPM 300 لكل ملليمتر مربع من إدراج السيليكون المختصر في حجم إجمالي من 40 إلى 50 ميكرولتر من وسيط ثقافة MEPM في كل إدراج لاحتضان بين عشية وضحاها في حاضنة ثقافة الخلية.

لإعداد اختبار إصلاح الجرح، استخدم ملقط معقم لوضع واحد غير معدلة إدخال السيليكون المعقمة اثنين من بئر في وسط بئر واحد من لوحة من ستة آبار لكل عينة واضغط بقوة حواف إدراج لإرفاق إدراج لوحة الثقافة. ثم البذور 1، 400 خلية لكل ملليمتر مربع في 100 ميكرولتر من المتوسطة ثقافة MEPM في كل إدراج واحتضان الخلايا لمدة 48 ساعة في وسط ثقافة الخلية. عند إجراء اختبار الهجرة الجماعية ثنائية الأبعاد ، فإن بذر الخلايا في إدراج السيليكون بشكلين في طبق ثقافة كبير يوفر عادة كثافة خلايا أفضل للتصوير.

يمكن أيضا استخدام الحلقات الصغيرة المطبوعة ثلاثية الأبعاد الموضوعة في طبق 35 ملليمترا لتحليل الحركة ثلاثية الأبعاد. لإجراء فحوصات إصلاح الجروح، تزرع الخلايا في إدراج السيليكون بشكلين حتى التقاء عال. ثم تتم إزالة الإدراجات ويتم تصوير الجرح حتى الإغلاق.

مسارات MEPM مستمرة ويتم الحفاظ على اتجاه حركة الخلية لعدة ساعات. ويشير متوسط الإزاحة مقابل تحليل الوقت إلى أن الثبات في شكل تشريد يتناسب مع الوقت المنقضي. يكشف تحليل التدفق لبيانات الحركة أن مجموعات خلايا MEPM المشاركة في الحركة تبلغ حوالي 300 ميكرون في الحجم.

ويلاحظ أيضا اختلاف الحركة العميق بين نوع البرية وخلايا MEPM متحولة. يمكن استخدام هذا الإجراء على مختلف خطوط الماوس المعدلة وراثيا وعلاج خلايا MEPM بأجهزة كاشفة كيميائية حيوية مختلفة لدراسة آثارها على حركة الخلايا. لقد ركزنا على خلايا الميسنشيم الأساسية، ولكن يمكن أيضا استخدام التصوير الفاصل الزمني والتحليلات الكمية لاستكشاف سمات الهجرة لأي نوع من أنواع الخلايا المتحركة في العمليات التنموية الديناميكية.