التعديلات الخاصة بالميوزين في المختبر المضان المقايسات الحركية المستندة إلى المجهر
February 4th, 2021
هنا هو إجراء للتعبير عن وتنقية الميوزين 5a تليها مناقشة توصيفه، وذلك باستخدام كل من الفرقة وجزيء واحد في المختبر مضان المقايسات المستندة إلى المجهر، وكيف يمكن تعديل هذه الأساليب لوصف غير عضلة ميوسين 2b.
يمكن استخدام هذا البروتوكول لتوصيف ديناميات الميوسين غير العضلية على مستوى البروتين ، والتي يمكن أن تبلغ الخصائص الحركية التي تساهم في أدوارها في الخلايا. هذه طريقة سريعة وقابلة للاستنساخ وخاضعة للرقابة للغاية يمكن استخدامها لدراسة آثار الظروف التنظيمية المختلفة على حركية الميوسين ، وإبلاغ سلوكياتهم الخلوية. يمكن استخدام هذه التقنيات للتحقيق في كيفية تأثير الطفرات المسببة للأمراض في الميوسين غير العضلي على سلوكياتها على مستوى الجزيء والفرقة الواحدة.
ويمكن تطبيق النهج العام لمنهجيته على مختلف النظم الهيكل الخلوي الأخرى، مثل توصيف kinesins المنقى وdyneins مع microtubules. يمكن أن تثير براعة هذا البروتوكول تساؤلات حول الفلوروفوريس والظروف الكيميائية الأكثر ملاءمة ، ولكن يمكن تحسين الطريقة بسرعة نسبية. فهم كيفية إعداد ومعطف غرف التدفق يجعل لأساس قوي على أي واحد يمكن أن تتكيف مع ظروف مختلفة لهذه التجارب.
للبدء، وإعداد محلول نيتروسيلولوس واحد في المئة في خلات أميل ووضع ورقة تصفية دائرية مع قطر 125 ملليمتر على الجزء السفلي من لوحة زراعة الأنسجة. تحميل ثمانية زلات غطاء مربع على رف وغسلها جيدا مع ما يقرب من 2-5 ملليلتر من الإيثانول واقية من 200 تليها اثنين إلى خمسة ملليلتر من الماء المقطر. ثم محرك الغطاء ينزلق تماما باستخدام خط الهواء المصفاة أو خط النيتروجين.
ماصة ببطء 10 ميكرولتر من محلول النيتروسليلوز واحد في المئة على طول حافة واحدة من زلة غطاء واحد. تشويه عبر بقية زلة الغطاء باستخدام جانب من طرف ماصة 200 ميكرولتر في حركة واحدة على نحو سلس. ثم ضع هذا الغطاء زلة على طبق زراعة الأنسجة مع الجانب نيتروسيلولوس حتى.
كرر هذا لزلات الغطاء المتبقية والسماح لهم لتجف. امسح شريحة المجهر بورق عدسة بصري لتنظيف الحطام الكبير. قطع قطعتين من الشريط على الوجهين، ما يقرب من سنتيمترين في الطول، ووضع قطعة واحدة على طول منتصف الحافة الطويلة من الشريحة المجهر.
ضع القطعة الثانية من الشريط ما يقرب من ملليمترين تحت القطعة الأولى من الشريط بحيث يتم إنشاء اثنين موازية غرفة تدفق التي يمكن أن تعقد ما يقرب من 10 ميكرولتر من الحل. عصا بعناية واحدة من غطاء نيتروسيلولوس زلات على الشريط بحيث الجانب المغلفة مع النيتروسليلوز هو إجراء اتصال مباشر مع الشريط. باستخدام طرف ماصة، اضغط برفق لأسفل على واجهة شريط الشرائح لضمان الالتزام بزلة الغطاء بشكل صحيح بالشريحة.
ثم قطع الشريط الزائد معلقة على حافة الشريحة مع شفرة حلاقة. إعداد حلول لميوسين 5a والاحتفاظ بها على الجليد. تدفق في 10 ميكرولتر من 5A Myosin من خلال غرفة تدفق الشريحة والانتظار لمدة دقيقة واحدة.
ثم تدفق في 10 ميكرولتر من مليغرام واحد لكل ملليلتر BSA في العازلة الحركة مع DTT. كرر هذا مرتين وانتظر دقيقة بعد الغسيل الثالث. استخدم ركن ورق الأنسجة أو ورق التصفية لتكتيل المحلول عبر القناة عن طريق وضع ركن الورق برفق عند مخرج غرفة التدفق.
ثم يغسل مع 10 ميكرولتر من العازلة الحركة مع DTT. ماصة حل أكتين الأسود مع حقنة ملليلتر واحد وإبرة قياس 27 لقص خيوط أكتين قبل إدخال هذا الحل إلى الغرفة. إضافة actin الأسود إلى الغرفة في وجود واحد ATP ملليمولار في 50 ملليمولار MB مع واحد DTT ملليمولار.
بعد ذلك ، تدفق في 50 ميكرولتر من العازلة الحركة مع DTT وATP ملليمولار واحد لاستنفاد غرفة خيوط أكتين الحرة. غسل مع 10 ميكرولتر من العازلة الحركة مع DTT ثلاث مرات لاستنفاد غرفة أي ATP. تدفق في 10 ميكرولتر من 20 نانومولار RH actin حل يحتوي على العازلة الحركة مع DTT والانتظار لمدة دقيقة واحدة للسماح لصرامة ملزمة من خيوط أكتين إلى 5a Myosin تعلق على سطح زلة الغطاء.
غسل مع 10 ميكرولتر من 50 ملليمولار حركية العازلة مع DTT مرتين لإزالة خيوط أكتين RH غير منضم. تدفق في 30 ميكرولتر من المخزن المؤقت النهائي. تسجيل الصور على المجهر الفلوري باستخدام الطول الموجي الإثارة من 561 نانومتر لتصور أكتين RH.
إعداد الحلول لميوسين 5a المقايسة الحركة مقلوب والاحتفاظ بها على الجليد. غسلها غرفة مع 10 ميكرولتر من العازلة الحركة مع DTT. تدفق في 10 ميكرولتر من مليغرام واحد لكل ملليلتر BSA في العازلة الحركة مع DTT.
كرر هذا مرتين، والانتظار دقيقة بعد الغسيل الثالث. استخدم الأنسجة أو ورق التصفية لتفتيت المحلول عبر القناة عن طريق وضع ركن الورق برفق عند مخرج غرفة التدفق. ثم، اغسل الغرفة مع 10 ميكرولتر من العازلة الحركة مع DTT ثلاث مرات.
تدفق في 10 ميكرولتر من محلول NeutrAvidin في العازلة الحركة مع DTT وانتظر لمدة دقيقة واحدة. ثم يغسل مع 10 ميكرولتر من هذا الحل ثلاث مرات. تدفق في 10 ميكرولتر من ACTIN BRH تحتوي على العازلة الحركة مع DTT باستخدام تلميح ماصة كبيرة بالملل.
وانتظر دقيقة واحدة. ثم، يغسل مع 10 ميكرولتر من العازلة الحركة مع DTT ثلاث مرات. تدفق في 30 ميكرولتر من العازلة النهائية مع 10 نانومولار Myosin 5a.
وتحميل فورا على المجهر الانعكاس الداخلي الكلي مضان. ابدأ التسجيل بمجرد العثور على التركيز الأمثل لتصوير TIRF. تم تقييم تنقية العضلات غير Myosin 2b، سلاسل الضوء الأساسية، وسلاسل الضوء التنظيمية، فضلا عن 5a Myosin وكالمودولين من خلال أداء SDS-PAGE.
يظهر مقايسة خيوط actin المزلقة خصائص فيلم مثالي وقابل للتتبع يتميز بحركات سلسة لخيوط أكتين المسماة. تضمن غسل أكتين الأسود إزالة رؤوس الميوسين الميتة من مجال القياس مما ساهم بشكل أكبر في الحركة السلسة الشاملة لخيوط أكتين. خيوط تتبع إخراج الصور من برنامج المسار السريع تم الحصول عليها لغير العضلات Myosin 2B و Myosin 5a.
ويبين الرسم البياني التمثيلي أن سرعة الانزلاق أكتوميوسين 2b هو 77 نانومتر في الثانية الواحدة. و أن أكتوميوسين 5a هو 515 نانومتر في الثانية الواحدة. في غياب ميثيلسليلوز، خيوط أكتين لا تبقى مرتبطة ارتباطا وثيقا من قبل السطح المغلفة الميوسين، مما تسبب في انها تتخبط على مقربة من سطح زلات غطاء غير العضلات ميوزين 2B المغلفة.
لوحظت حركة الميسين على خيوط اللافتسنت المربوطة بالسطح باستخدام المقايسة الحركية المقلوبة. من المهم قص أكتين غير التسطير قبل عرضه على خلية التدفق لغسل أكتين الأسود الذي سيسمح بنقل سلس من أكتين. يمكن للتجارب الإضافية التحقيق في كيفية تأثر حركية الميسين بطفرات الميسين والبروتينات المحفزة للتحميل والقوة الأيونية والبروتينات التنظيمية.
يمكن إعادة تشكيل مختلف الظروف الخلوية للدراسات المستقبلية. تسمح هذه الطرق بإجراء تحقيقات بيوكيميائية وبيولوجية في كيفية اختلاف أشكال الميسين المختلفة في خصائصها الحركية والميكانكية على مستوى الجزيء والفرقة الواحدة.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
يوضح هذا البروتوكول التعبير والتنقية عن الميوسين 5a، متبوعًا بتوضيحه باستخدام مقايسات الميكروسكوب الفلوري داخل المختبر. كما يناقش التعديلات اللازمة لدراسة الميوسين غير العضلي 2b.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- الكيمياء الحيوية
- بيولوجيا الخلية
- علم الأعصاب
الخلفية
- تلعب الميوسينات أدوارًا حرجة في حركة الخلايا.
- فهم ديناميات الميوسين ضروري لتوضيح وظائفها في الخلايا.
- الميوسينات غير العضلية متورطة في عمليات خلوية مختلفة.
- تقنيات التوصيف يمكن أن تكشف تأثير الطفرات على سلوك الميوسين.
غرض الدراسة
- توضيح ديناميات الميوسين غير العضلي على مستوى البروتين.
- إطلاع على الخصائص الحركية التي تساهم في الأدوار الخلوية.
- التحقيق في تأثيرات الظروف التنظيمية على حركة الميوسين.
الطرق المستخدمة
- الميكروسكوب الفلوري الجماعي والفردي.
- توضيح الميوسينات المنقاة.
- تحسين الفلوروفورات والظروف الكيميائية.
- إعداد وتغليف غرف التدفق للتجارب.
النتائج الرئيسية
- البروتكول سريع وقابل للتكرار ومتحكم فيه بشكل كبير.
- يسمح بدراسة الطفرات المسببة للأمراض في الميوسينات غير العضلية.
- منهجية متعددة الاستخدامات قابلة للتطبيق على أنظمة الهيكل الخلوي الأخرى.
- تحسين سريع لظروف تجريبية مختلفة.
الاستنتاجات
- فهم ديناميات الميوسين يعزز المعرفة بالسلوكيات الخلوية.
- توفر هذه الطريقة أساسًا قويًا للدراسات المستقبلية.
- تثير أسئلة مهمة بشأن وظيفة الميوسين في الصحة والمرض.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
This protocol enables quantitative characterization of myosin motility at single molecule and ensemble levels, providing mechanistic insights into motor protein function. It supports target validation by linking biochemical properties to cellular phenotypes, informing de-risking of myosin-directed therapeutic strategies. The approach is adaptable to disease-relevant models, facilitating preclinical evaluation of myosin isoform dynamics under controlled conditions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of myosin mechanochemistry to clarify functional roles in cellular transport and adhesion.
- Operational Value: Provides reproducible, quantitative readouts of translocation velocity and run length for target engagement assessment.
- Predictive Value: Supports hypothesis testing of how regulatory conditions or mutations alter motor protein behavior, aiding in target confidence scoring.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, fluorescence-based motility assays compatible with high-content imaging for compound screening.
- Quantitative Output: Delivers measurable parameters such as actin translocation velocity and single molecule run length for dose-response analysis.
- Platform Reuse: Adaptable to other cytoskeletal systems (e.g., kinesin/dynein with microtubules), enabling cross-target assay portability.
Translational & Preclinical Research
- Disease Modeling: Allows reconstitution of cellular conditions to study disease-causing mutations in non-muscle myosins at the protein level.
- Mechanistic De-risking: Links molecular motility defects to cellular phenotypes, supporting translational biomarker alignment.
- Preclinical Continuity: Bridges discovery-stage target validation with preclinical functional assessment through conserved assay format.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation to lead optimization, offering biophysical characterization that informs structure-function relationships in motor proteins.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and functional validation of myosin isoforms through direct observation of motility dynamics.
- Screening: Enables assay standardization and reproducibility for evaluating compound effects on motor protein activity under controlled buffer conditions.
- Analytics: Provides quantitative measurements of velocity and processivity that allow comparison across isoforms, mutants, or treatment conditions.
- Translational Research: Connects single molecule behavior to ensemble-level outputs relevant to cellular functions like cytokinesis and tension maintenance.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for studying diverse motor proteins across therapeutic areas, reducing assay redevelopment effort.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing ambiguity in myosin mechanochemical coupling.
- Operational Value: Ensures assay reproducibility and standardization across laboratories through defined flow chamber preparation and imaging protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early detection of motility-altering mutations or regulatory effects.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of myosin targets based on validated functional domains and motility profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein purification, fluorescence microscopy, and image analysis for motility tracking.
- Depends on access to TIRF or widefield fluorescence microscopy systems and flow chamber fabrication capabilities.
- Necessitates standardization of buffer conditions, ATP concentrations, and fluorophore selection across experimental replicates.
- Involves optimization considerations for different myosin isoforms regarding surface density, ionic strength, and regulatory protein inclusion.
- Limited by the need for purified, functional protein preparations; activity may be affected by tags, degradation, or improper folding.
