التعديلات الخاصة بالميوزين في المختبر المضان المقايسات الحركية المستندة إلى المجهر
فبراير 4, 2021
هنا هو إجراء للتعبير عن وتنقية الميوزين 5a تليها مناقشة توصيفه، وذلك باستخدام كل من الفرقة وجزيء واحد في المختبر مضان المقايسات المستندة إلى المجهر، وكيف يمكن تعديل هذه الأساليب لوصف غير عضلة ميوسين 2b.
يمكن استخدام هذا البروتوكول لتوصيف ديناميات الميوسين غير العضلية على مستوى البروتين ، والتي يمكن أن تبلغ الخصائص الحركية التي تساهم في أدوارها في الخلايا. هذه طريقة سريعة وقابلة للاستنساخ وخاضعة للرقابة للغاية يمكن استخدامها لدراسة آثار الظروف التنظيمية المختلفة على حركية الميوسين ، وإبلاغ سلوكياتهم الخلوية. يمكن استخدام هذه التقنيات للتحقيق في كيفية تأثير الطفرات المسببة للأمراض في الميوسين غير العضلي على سلوكياتها على مستوى الجزيء والفرقة الواحدة.
ويمكن تطبيق النهج العام لمنهجيته على مختلف النظم الهيكل الخلوي الأخرى، مثل توصيف kinesins المنقى وdyneins مع microtubules. يمكن أن تثير براعة هذا البروتوكول تساؤلات حول الفلوروفوريس والظروف الكيميائية الأكثر ملاءمة ، ولكن يمكن تحسين الطريقة بسرعة نسبية. فهم كيفية إعداد ومعطف غرف التدفق يجعل لأساس قوي على أي واحد يمكن أن تتكيف مع ظروف مختلفة لهذه التجارب.
للبدء، وإعداد محلول نيتروسيلولوس واحد في المئة في خلات أميل ووضع ورقة تصفية دائرية مع قطر 125 ملليمتر على الجزء السفلي من لوحة زراعة الأنسجة. تحميل ثمانية زلات غطاء مربع على رف وغسلها جيدا مع ما يقرب من 2-5 ملليلتر من الإيثانول واقية من 200 تليها اثنين إلى خمسة ملليلتر من الماء المقطر. ثم محرك الغطاء ينزلق تماما باستخدام خط الهواء المصفاة أو خط النيتروجين.
ماصة ببطء 10 ميكرولتر من محلول النيتروسليلوز واحد في المئة على طول حافة واحدة من زلة غطاء واحد. تشويه عبر بقية زلة الغطاء باستخدام جانب من طرف ماصة 200 ميكرولتر في حركة واحدة على نحو سلس. ثم ضع هذا الغطاء زلة على طبق زراعة الأنسجة مع الجانب نيتروسيلولوس حتى.
كرر هذا لزلات الغطاء المتبقية والسماح لهم لتجف. امسح شريحة المجهر بورق عدسة بصري لتنظيف الحطام الكبير. قطع قطعتين من الشريط على الوجهين، ما يقرب من سنتيمترين في الطول، ووضع قطعة واحدة على طول منتصف الحافة الطويلة من الشريحة المجهر.
ضع القطعة الثانية من الشريط ما يقرب من ملليمترين تحت القطعة الأولى من الشريط بحيث يتم إنشاء اثنين موازية غرفة تدفق التي يمكن أن تعقد ما يقرب من 10 ميكرولتر من الحل. عصا بعناية واحدة من غطاء نيتروسيلولوس زلات على الشريط بحيث الجانب المغلفة مع النيتروسليلوز هو إجراء اتصال مباشر مع الشريط. باستخدام طرف ماصة، اضغط برفق لأسفل على واجهة شريط الشرائح لضمان الالتزام بزلة الغطاء بشكل صحيح بالشريحة.
ثم قطع الشريط الزائد معلقة على حافة الشريحة مع شفرة حلاقة. إعداد حلول لميوسين 5a والاحتفاظ بها على الجليد. تدفق في 10 ميكرولتر من 5A Myosin من خلال غرفة تدفق الشريحة والانتظار لمدة دقيقة واحدة.
ثم تدفق في 10 ميكرولتر من مليغرام واحد لكل ملليلتر BSA في العازلة الحركة مع DTT. كرر هذا مرتين وانتظر دقيقة بعد الغسيل الثالث. استخدم ركن ورق الأنسجة أو ورق التصفية لتكتيل المحلول عبر القناة عن طريق وضع ركن الورق برفق عند مخرج غرفة التدفق.
ثم يغسل مع 10 ميكرولتر من العازلة الحركة مع DTT. ماصة حل أكتين الأسود مع حقنة ملليلتر واحد وإبرة قياس 27 لقص خيوط أكتين قبل إدخال هذا الحل إلى الغرفة. إضافة actin الأسود إلى الغرفة في وجود واحد ATP ملليمولار في 50 ملليمولار MB مع واحد DTT ملليمولار.
بعد ذلك ، تدفق في 50 ميكرولتر من العازلة الحركة مع DTT وATP ملليمولار واحد لاستنفاد غرفة خيوط أكتين الحرة. غسل مع 10 ميكرولتر من العازلة الحركة مع DTT ثلاث مرات لاستنفاد غرفة أي ATP. تدفق في 10 ميكرولتر من 20 نانومولار RH actin حل يحتوي على العازلة الحركة مع DTT والانتظار لمدة دقيقة واحدة للسماح لصرامة ملزمة من خيوط أكتين إلى 5a Myosin تعلق على سطح زلة الغطاء.
غسل مع 10 ميكرولتر من 50 ملليمولار حركية العازلة مع DTT مرتين لإزالة خيوط أكتين RH غير منضم. تدفق في 30 ميكرولتر من المخزن المؤقت النهائي. تسجيل الصور على المجهر الفلوري باستخدام الطول الموجي الإثارة من 561 نانومتر لتصور أكتين RH.
إعداد الحلول لميوسين 5a المقايسة الحركة مقلوب والاحتفاظ بها على الجليد. غسلها غرفة مع 10 ميكرولتر من العازلة الحركة مع DTT. تدفق في 10 ميكرولتر من مليغرام واحد لكل ملليلتر BSA في العازلة الحركة مع DTT.
كرر هذا مرتين، والانتظار دقيقة بعد الغسيل الثالث. استخدم الأنسجة أو ورق التصفية لتفتيت المحلول عبر القناة عن طريق وضع ركن الورق برفق عند مخرج غرفة التدفق. ثم، اغسل الغرفة مع 10 ميكرولتر من العازلة الحركة مع DTT ثلاث مرات.
تدفق في 10 ميكرولتر من محلول NeutrAvidin في العازلة الحركة مع DTT وانتظر لمدة دقيقة واحدة. ثم يغسل مع 10 ميكرولتر من هذا الحل ثلاث مرات. تدفق في 10 ميكرولتر من ACTIN BRH تحتوي على العازلة الحركة مع DTT باستخدام تلميح ماصة كبيرة بالملل.
وانتظر دقيقة واحدة. ثم، يغسل مع 10 ميكرولتر من العازلة الحركة مع DTT ثلاث مرات. تدفق في 30 ميكرولتر من العازلة النهائية مع 10 نانومولار Myosin 5a.
وتحميل فورا على المجهر الانعكاس الداخلي الكلي مضان. ابدأ التسجيل بمجرد العثور على التركيز الأمثل لتصوير TIRF. تم تقييم تنقية العضلات غير Myosin 2b، سلاسل الضوء الأساسية، وسلاسل الضوء التنظيمية، فضلا عن 5a Myosin وكالمودولين من خلال أداء SDS-PAGE.
يظهر مقايسة خيوط actin المزلقة خصائص فيلم مثالي وقابل للتتبع يتميز بحركات سلسة لخيوط أكتين المسماة. تضمن غسل أكتين الأسود إزالة رؤوس الميوسين الميتة من مجال القياس مما ساهم بشكل أكبر في الحركة السلسة الشاملة لخيوط أكتين. خيوط تتبع إخراج الصور من برنامج المسار السريع تم الحصول عليها لغير العضلات Myosin 2B و Myosin 5a.
ويبين الرسم البياني التمثيلي أن سرعة الانزلاق أكتوميوسين 2b هو 77 نانومتر في الثانية الواحدة. و أن أكتوميوسين 5a هو 515 نانومتر في الثانية الواحدة. في غياب ميثيلسليلوز، خيوط أكتين لا تبقى مرتبطة ارتباطا وثيقا من قبل السطح المغلفة الميوسين، مما تسبب في انها تتخبط على مقربة من سطح زلات غطاء غير العضلات ميوزين 2B المغلفة.
لوحظت حركة الميسين على خيوط اللافتسنت المربوطة بالسطح باستخدام المقايسة الحركية المقلوبة. من المهم قص أكتين غير التسطير قبل عرضه على خلية التدفق لغسل أكتين الأسود الذي سيسمح بنقل سلس من أكتين. يمكن للتجارب الإضافية التحقيق في كيفية تأثر حركية الميسين بطفرات الميسين والبروتينات المحفزة للتحميل والقوة الأيونية والبروتينات التنظيمية.
يمكن إعادة تشكيل مختلف الظروف الخلوية للدراسات المستقبلية. تسمح هذه الطرق بإجراء تحقيقات بيوكيميائية وبيولوجية في كيفية اختلاف أشكال الميسين المختلفة في خصائصها الحركية والميكانكية على مستوى الجزيء والفرقة الواحدة.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
يفصل هذا البروتوكول عملية تعبير وتنقية الميوزين 5a، متبوعة بتوصيفه باستخدام مقاييس مجهر الفلورسنس في المختبر. كما يناقش التعديلات اللازمة لدراسة الميوزين غير العضلي 2b.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- الكيمياء الحيوية
- بيولوجيا الخلية
- علوم الأعصاب
خلفية علمية
- تلعب الميوسينات أدواراً حاسمة في الحركية الخلوية.
- يعد فهم ديناميكيات الميوسين أمراً أساسياً لتوضيح وظائفها في الخلايا.
- تشارك الميوسينات غير العضلية في عمليات خلوية متنوعة.
- يمكن لتقنيات التوصيف أن تكشف عن تأثير الطفرات على سلوك الميوسين.
الغرض من الدراسة
- توصيف ديناميكيات الميوسين غير العضلي على مستوى البروتين.
- تقديم معلومات حول الخصائص الحركية التي تساهم في الأدوار الخلوية.
- استقصاء تأثيرات الظروف التنظيمية على حركية الميوسين.
الطرق المستخدمة
- المجهر الفلوري للجزيئات الفردية والمجموعات.
- توصيف بروتينات الميوسين المنقاة.
- تحسين الفلوروفورات والظروف الكيميائية.
- إعداد وطلاء غرف التدفق للتجارب.
النتائج الرئيسية
- يتميز هذا البروتوكول بالسرعة، وقابلية التكرار، والتحكم العالي.
- يتيح البروتوكول دراسة الطفرات المسببة للأمراض في الميوسينات غير العضلية.
- منهجية متعددة الاستخدامات يمكن تطبيقها على أنظمة الهياكل الخلوية الأخرى.
- تحسين سريع لمختلف الظروف التجريبية.
الاستنتاجات
- يعزز فهم ديناميكيات الميوزين المعرفة بالسلوكيات الخلوية.
- توفر هذه الطريقة أساساً قوياً للدراسات المستقبلية.
- إنها تثير تساؤلات مهمة فيما يتعلق بوظيفة الميوزين في حالتي الصحة والمرض.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
يتيح هذا البروتوكول التوصيف الكمي لحركة الميوزين على مستويي الجزيء المنفرد والمجموعات الجزيئية، مما يوفر رؤى ميكانيكية حول وظيفة البروتين المحرك. كما يدعم عملية التحقق من الأهداف من خلال ربط الخصائص البيوكيميائية بالأنماط الظاهرية الخلوية، مما يساعد في تقليل المخاطر المرتبطة بالاستراتيجيات العلاجية الموجهة ضد الميوزين. ويتميز هذا النهج بقابليته للتكيف مع النماذج ذات الصلة بالأمراض، مما يسهل التقييم قبل السريري لديناميكيات الأشكال الإسوية للميوزين تحت ظروف مضبوطة.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: تمكّن من استقصاء الكيمياء الميكانيكية للميوزين لتوضيح الأدوار الوظيفية في النقل والالتصاق الخلوي.
- القيمة التشغيلية: توفر قراءات كمية قابلة للتكرار لسرعة الانتقال وطول المسافة المقطوعة لتقييم ارتباط الهدف.
- القيمة التنبؤية: تدعم اختبار الفرضيات حول كيفية تأثير الظروف التنظيمية أو الطفرات على سلوك البروتين المحرك، مما يساعد في تسجيل درجات الثقة في الهدف.
الفحص وتطوير المقايسة
- جاهزية المقايسة: تُنتج مقايسات حركة قياسية تعتمد على الفلورة وتتوافق مع التصوير عالي المحتوى لفحص المركبات.
- المخرجات الكمية: توفر معاملات قابلة للقياس مثل سرعة انتقال actin وطول المسار للجزيء الواحد لتحليل الاستجابة للجرعة.
- إعادة استخدام المنصة: قابلة للتكيف مع أنظمة الهيكل الخلوي الأخرى (مثل kinesin/dynein مع microtubules)، مما يتيح إمكانية نقل المقايسة عبر أهداف مختلفة.
الأبحاث الانتقالية وقبل السريرية
- نمذجة الأمراض: تتيح إعادة تشكيل الظروف الخلوية لدراسة الطفرات المسببة للأمراض في الميوزينات غير العضلية على مستوى البروتين.
- تقليل المخاطر الميكانيكية: تربط عيوب الحركية الجزيئية بالأنماط الظاهرية الخلوية، مما يدعم مواءمة المؤشرات الحيوية الانتقالية.
- الاستمرارية قبل السريرية: تجسر الفجوة بين مرحلة التحقق من الهدف في مرحلة الاكتشاف والتقييم الوظيفي قبل السريري من خلال تنسيق اختبار موحد.
تكامل مسار العمل والتدفق الإجرائي
تندرج هذه الطريقة ضمن سلسلة عمليات الاكتشاف بدءاً من التحقق من الهدف وصولاً إلى تحسين الرصاصة، حيث توفر توصيفاً بيوفيزيائياً يساهم في فهم علاقات البنية والوظيفة في البروتينات الحركية.
- بيولوجيا الاكتشاف: يدعم توضيح المسارات والتحقق الوظيفي من الأشكال الإسوية للميوسين من خلال الملاحظة المباشرة لديناميكيات الحركة.
- الفحص: يتيح توحيد المقايسات وقابلية تكرارها لتقييم تأثيرات المركبات على نشاط البروتينات الحركية تحت ظروف منظمة من المحلول المنظم.
- التحليلات: يوفر قياسات كمية للسرعة والقدرة المعالجية تسمح بالمقارنة بين الأشكال الإسوية، أو الطفرات، أو ظروف المعالجة.
- الأبحاث الانتقالية: يربط سلوك الجزيء الواحد بالمخرجات على مستوى المجموعة ذات الصلة بالوظائف الخلوية مثل انقسام السيتوبلازم والحفاظ على التوتر.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: يؤسس منصة قابلة لإعادة الاستخدام لدراسة البروتينات الحركية المتنوعة عبر المجالات العلاجية، مما يقلل الجهد المبذول في إعادة تطوير المقايسات.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تزيد من الثقة التنبؤية في التحقق من الأهداف من خلال تقليل الغموض في الاقتران الميكانيكي الكيميائي للميوسين.
- القيمة التشغيلية: تضمن تكرار المقايسة وتوحيدها عبر المختبرات من خلال بروتوكولات محددة لتحضير غرفة التدفق والتصوير.
- القيمة الاستراتيجية: تحسن قرارات المضي قدماً أو التوقف من خلال تمكين الكشف المبكر عن الطفرات المغيرة للحركة أو التأثيرات التنظيمية.
- التأثير على المحفظة: تسهل تحديد الأولويات المعدلة حسب المخاطر لأهداف الميوسين بناءً على النطاقات الوظيفية الموثقة وملفات الحركة.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في تنقية البروتين، والمجهر الفلوري، وتحليل الصور لتتبع الحركة.
- يعتمد على توفر أنظمة المجهر الفلوري بنظام TIRF أو المجهر ذو المجال الواسع وقدرات تصنيع غرف التدفق.
- يستلزم توحيد ظروف المحلول المنظم، وتركيزات ATP، واختيار الفلوروفور عبر المكررات التجريبية.
- يتضمن اعتبارات التحسين لمختلف نظائر الميوسين فيما يتعلق بالكثافة السطحية، والقوة الأيونية، وإدراج البروتينات التنظيمية.
- يتقيد بالحاجة إلى تحضيرات بروتينية نقية ووظيفية؛ حيث قد تتأثر الفعالية بالعلامات، أو التحلل، أو الطي غير الصحيح.
