Name: إعداد الشبكة السريعة للمجهر Cryo-Electron الذي تم حله زمنيا (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: اكتشف بروتوكول إعداد الشبكات السريع للمجهر الإلكتروني المبرد المُحلّل زمنياً باستخدام جهاز مخصص. يتيح هذا الأسلوب التقاط الحالات الوسيطة العابرة للبروتينات بدقة زمنية تصل إلى 10 مللي ثانية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

نود أن نشكر مولي س.C. غريفت على المناقشات المفيدة وموظفي مرفق ABSL للمساعدة في جمع البيانات cryo-EM. ديفيد ب. كليبل هو طالب دكتوراه في برنامج ويلكوم ترست للدكتوراه لمدة 4 سنوات في مركز أستبري بتمويل من جامعة ليدز. تم تمويل مجاهر FEI Titan Krios من قبل جامعة ليدز (جائزة UoL ABSL) و Wellcome Trust (108466/Z/15/Z). تم تمويل هذا العمل من خلال منحة BBSRC لستيفن ب. موينش (BB/P026397/1) ودعمت بمنح بحثية لهوارد د. وايت من جمعية القلب الأمريكية (AMR21-236078) وهوارد د. وايت وفيتولد غالكين من المعاهد القومية للصحة الأمريكية (171261).

1. إعداد النظام
ملاحظة: يصف البروتوكول التالي كيفية تحضير شبكات نموذج واحد. عادة، يتم إعداد شبكات النسخ المتماثل 2 كحد أدنى لكل عينة أو شرط. لسرعات الهبوط الأسرع (أقل من ~ 20 مللي ثانية تأخير الوقت)، وعادة ما تكون على استعداد 3 أو 4 شبكات تكرار لحساب عدد أقل من مناطق الجليد رقيقة.
<ol><li>تمييع عينة البروتين إلى التركيز المستهدف في العازلة المطلوبة. عادة، التركيزات النهائية ≥ 2 ملغم/مل تعمل بشكل جيد لإعداد الشبكة مع تيد. لاحظ أنه يمكن الاحتفاظ بالعينة على الجليد حتى الخطوة 10 ، من الخطوة 10 فصاعدا ستقضي العينة وقتا طويلا في درجة حرارة الغرفة حيث تستغرق حوالي 20 دقيقة لإعداد شبكات 3-4.</li>
	<li>قم بتشغيل TED. ثم قم بتشغيل جهاز التحكم وبدء تشغيل برنامج التحكم.</li>
	<li>تهيئة جميع مضخات الحقنة عن طريق الضغط على زر التهيئة (الزر الأسود السفلي) على كل مضخة حقنة.</li>
	<li>قم بتشغيل مصدر الطاقة القوي، واضبطه على 9 فولت وابدأ تشغيل برنامج التحكم في الذبذبات.</li>
	<li>تأكد من إغلاق الصمام التنظيمي للأسطوانات N2. افتح صمام الأسطوانة. ثم، فتح ببطء صمام المنظم وضع الضغط منفذ للقيمة المطلوبة لضغط الغاز رذاذ (عادة 1-2 بار). بالنسبة ل وفوهات PDMS المستخدمة هنا ، لا تستخدم ضغوطا أعلى من ~ 2.5 شريط لتجنب تلف الفوهة. يمنع الغاز المتدفق باستمرار السائل من التنقيط والتراكم عند طرف الفوهة مما قد يؤدي إلى رش غير قابل للتدمير.</li>
	<li>تأكد من أن جميع صمامات مضخة المحاقن في وضع "الحمل". ويمكن القيام بذلك عن طريق تبديل جميع الصمامات إلى موقف "الاستغناء" في برنامج التحكم ومن ثم العودة إلى "تحميل". اترك جميع الصمامات تتحول إلى "تحميل". تعيين جميع المحاقن إلى الصفر.</li>
	<li>إزالة أي فقاعات الهواء موجودة في النظام في هذه المرحلة. للقيام بذلك، قد يكون المحاقن أن تكون غير مفككة، فقاعات إزالتها يدويا والمحاقن التي شنت مرة أخرى عند احتواء أي فقاعات أكثر.</li>
	<li>عادة ما يتم تخزين مكونات المناولة السائلة في H2O. قبل تحميل حل العينة، توازن النظام السائل مع المخزن المؤقت عن طريق غسل الأنابيب مع فائض من العازلة. استخدم معدل تدفق السائل الأقصى المناسب لتجنب الضغط الزائد على فوهة الرذاذ. قد تتسبب معدلات التدفق السائلة > 10 ميكرولتر /ثانية في تلف فوهات PDMS الموضحة هنا.</li>
	<li>ضع أنبوبا سعة 1.5 مل يحتوي على ≥ 200 ميكرولتر على حقنة 1 (يجب ثقب الجزء العلوي لإرفاقه بالأنابيب).<ol>
<li>تأكد من أن الصمام 1 في وضع "الحمل". التبديل في برنامج التحكم، إذا لزم الأمر.</li>
		<li>يستنشق الكمية المطلوبة (عادة 50-100 ميكرولتر) من المخزن المؤقت مع حقنة 1 ، من خلال برنامج التحكم.</li>
		<li>قم بتبديل الصمام 1 إلى موضع "الاستغناء"، من خلال برنامج التحكم.</li>
		<li>الاستغناء عن كل من السائل في حقنة 1، من خلال برنامج التحكم.</li>
		<li>عودة صمام إلى 'تحميل'، إعادة تعيين موقف حقنة إلى '0' في البرنامج واضغط تهيئة على حقنة 1، لإعداد النظام للدورة القادمة. ملاحظة: عادة ما تتكرر الخطوات 1.9.1 - 1.9.5 ثلاث مرات لضمان غسل شامل للأنابيب.</li>
	</ol></li>
	<li>تحميل ملاقط مع شبكة م (أي شرط لأي نوع معين) عن طريق تخفيف المشبك الذراع يغرق، ووضع ملاقط في المشبك وتشديد المشبك.</li>
	<li>يدويا تحريك الذراع يغرق بحيث الشبكة وفوهة هي في نفس الارتفاع ("تطبيق عينة" الموقف). إذا تم محاذاة الفوهة والشبكة ، فسيتراكم السائل على الشبكة بعد الرش لفترة طويلة. إذا لزم الأمر، قم بضبط موضع الفوهة.</li>
	<li>ضبط موقف كوب الإيثان السائل عن طريق تحريك الذراع يغرق يدويا مع ملاقط شنت إلى موقفها النهائي (الوصول إلى كأس الإيثان). عند إعدادها بشكل صحيح ، ستصل الشبكة التي تحتفظ بها الملاقط إلى مركز كوب الإيثان السائل تقريبا.</li>
	<li>تحقق من أن "تشغيل البرنامج النصي" سيستخدم معدلات التدفق ووحدات التخزين والتوقيت المطلوبة. راجع القسم 'تسلسل التشغيل' أعلاه للحصول على التفاصيل.</li>
	<li>تأكد من أن لا شيء يعيق مسار المكبس. يستنشق حجم المخزن المؤقت المطلوب لتشغيل واحد في حقنة 1. ويتم ذلك في برنامج التحكم، راجع قسم "تسلسل التشغيل" لإعداد نموذجي ووحدات التخزين. ثم تأكد من تحويل الصمام 1 إلى وضع "الاستغناء". إجراء اختبار تشغيل عن طريق الضغط على تشغيل البرنامج النصي في برنامج التحكم. تنبيه: ابتعد عن TED حتى ينتهي تسلسل التشغيل. الأجزاء المتحركة يمكن أن تسبب الإصابة!</li>
	<li>عند الانتهاء من "تسلسل التشغيل"، قم بتعيين الضغط على الذراع المنغمس إلى القيمة المطلوبة (عادة 1-2 بار). ثم فقط اضغط موافق في برنامج التحكم للافراج عن الضغط من الذراع يغرق. إذا كان "تسلسل التشغيل" أو الضغط على الذراع المغرق بحاجة إلى تعديل ، فقد يتم تغيير هذه الإعدادات في هذه المرحلة والخطوات 1.13 - 1.15 المتكررة.</li>
</ol>2. إعداد الشبكة السريعة
<ol><li>ملء السائل الإيثان / النيتروجين حاوية الأولى مع النيتروجين السائل. عندما تكون باردة بما فيه الكفاية وخالية من النيتروجين السائل، وملء الكأس مع الإيثان السائل. تجنب تجسيد الإيثان السائل. هذه الخطوة هي نفسها لإعداد الشبكة التقليدية. ملاحظة: لتقليل تلوث الإيثان، تأكد من تنفيذ الخطوات 2.2 -2.13 في أسرع وقت ممكن تنبيه: الإيثان السائل هو cryogen والقابلة للاشتعال. يجب توخي الحذر عند التعامل معها.</li>
	<li>إعداد شبكات التبريد م لتوهج التفريغ. نحن عادة ما نستخدم شبكات الكربون هولي وتوهج التفريغ لمدة 90 ثانية، في ضغط الهواء 0.1 mbar و 10 MA. عادة، لا يتم تفريغ أكثر من 4 شبكات في وقت واحد. وتستخدم الشبكات في غضون 30 دقيقة من توهج تفريغ.</li>
	<li>إعادة توازن الأنابيب مع عينة (باتباع الخطوات 1.9.1 - 1.9.5، باستخدام عينة بدلا من المخزن المؤقت). إذا كان حجم العينة المتوفرة منخفضا، فقد يتم إعادة توازن الأنابيب بحجم واحد فقط.</li>
	<li>يستنشق كمية العينة المطلوبة لتشغيل واحد في حقنة 1 في برنامج التحكم (انظر القسم 'تسلسل التشغيل' للحصول على التفاصيل). ثم قم بتبديل الصمام 1 إلى موضع "الاستغناء".</li>
	<li>تأكد من أن الرطوبة النسبية قد وصلت إلى القيمة المطلوبة (نحن عادة ما نعد الشبكات بنسبة 60٪ رطوبة نسبية أو أعلى). بمجرد ≥ الرطوبة 60 ٪ يتم التوصل إليها ، وفتح غرفة الرطوبة فقط لفترة ضئيلة من الوقت ، للحفاظ على رطوبة عالية.</li>
	<li>ضع الملاقط ، مع عقد شبكة توهج تفريغها ، في المكبس الهوائي وإصلاحها. نقل المكبس إلى موضع البداية (في الأعلى).</li>
	<li>تأكد من أن شريط التمرير الخاص بمقياس القوة في موضع البداية ، جاهزا للقياس ، عن طريق تحريكه يدويا للاتصال بالمغطاس. تعيين المشغل على منظار الذبذبات في برنامج الذبذبات.</li>
	<li>ضع حاوية الإيثان/النيتروجين السائلة.</li>
	<li>اضغط على تشغيل البرنامج النصي في برنامج التحكم. عند مطالبتك، انقر فوق موافق في برنامج التحكم لبدء التشغيل. تنبيه: ابتعد عن TED حتى ينتهي تسلسل التشغيل. الأجزاء المتحركة يمكن أن تسبب الإصابة!</li>
	<li>بمجرد الانتهاء من "تسلسل التشغيل" ، قم بتحرير الضغط على المكبس الهوائي بالنقر فوق موافق في برنامج التحكم.</li>
	<li>فتح غرفة الرطوبة، وتخفيف الصلة بين الذراع يغرق وملاقط بيد واحدة في حين تأمين ملاقط مع الآخر. عندما تكون الملاقط حرة، تحريك الذراع يغرق مع الحفاظ على الشبكة في الإيثان السائل. ثم نقل الشبكة إلى مساحة التخزين في السائل المحيط N2. بعد التجميد، يجب الاحتفاظ بالشبكة عند درجة حرارة N2 السائلة في جميع الأوقات.</li>
	<li>حفظ قياس الذبذبات. يدويا إعادة تعيين موقف شريط التمرير عداد القوة والغطاس بعد ذلك.</li>
	<li>كرر الخطوات 2.4-2.12 لإعداد شبكات النسخ المتماثل</li>
	<li>نقل الشبكات إلى التخزين طويل الأجل حتى قص الشبكة وجمع البيانات.</li>
	<li>اغسل النظام بالمخزن المؤقت، وفقا للخطوات 1.9.1 - 1.9.5. ثم غسل النظام مع H2O، وفقا للخطوات 1.9.1 - 1.9.5.</li>
	<li>إيقاف منظم غاز النيتروجين الرئيسي وإيقاف تشغيل الطاقة.</li>
	<li>ضع حاوية الإيثان/النيتروجين في غطاء الدخان للسماح لها بالإحماء والسماح للسيل إيثان وN2 بالتبخر.</li>
</ol>3. وقت حل cryo-EM
ملاحظة: عند إجراء التجارب التي تم حلها مع TED، هناك جوانب إضافية يجب مراعاتها، على الرغم من أن الإعداد الأساسي والمتغيرات تبقى كما هي. ويفترض هنا أن هناك حلين مختلطين في نسبة 1:1 (v/v) لإنتاج الخليط النهائي الذي يتم إيداعه على الشبكة. اتبع البروتوكول الموضح في '1. إعداد الشبكة بسرعة مع TED' ، مع التغييرات التالية:
<ol><li>استخدام تركيزات المخزون أعلى لتجارب خلط من لتجارب رش بسيطة. خلط في 1:1 (v/v) نسبة سيؤدي إلى تخفيف 2X من كل عنصر.</li>
	<li>لتجربة خلط سريع، استخدم جميع المحاقن الثلاثة بدلا من حقنة واحدة فقط.<ol>
<li>إرفاق أنابيب إلى مضخات حقنة 2-3.</li>
		<li>إرفاق أنابيب من مضخات حقنة 2-3 إلى فوهة رذاذ.</li>
		<li>توازن جميع المحاقن الثلاثة في العازلة وعينة على حدة. عادة، يتم تعبئة حقنة 1 مع عينة A والمحاقن 2-3 تمتلئ العينة B (الشكل 3).</li>
	</ol>
</li>
	<li>تغيير تسلسل التشغيل. مثال على تسلسل تشغيل باستخدام جميع المحاقن 3 لتجربة خلط السريع هو في الشكل 6. انظر أيضا قسم "تسلسل التشغيل" للحصول على التفاصيل.</li>
	<li>يمكن تحقيق تأخيرات زمنية مختلفة بطريقتين:<ol>
<li>تغيير سرعة المكبس. عن طريق ضبط سرعة المكبس، يمكن تغيير تأخير الوقت في نطاق ضيق نسبيا. على سبيل المثال، مع مسافة رذاذ / الإيثان من 2 سم، يمكن نقل المكبس في 1 م / ثانية أو 2 م / ث لإعطاء تأخير زمني قدره 20 مللي ثانية أو 10 مللي ثانية، على التوالي. ويتم ذلك على النحو المبين في الخطوة 1-15.</li>
		<li>تغيير موقف رذاذ / الإيثان عن طريق ضبط الموقف (العمودي) من فوهة رذاذ. إذا تم وضع الفوهة على مسافة 5 سم من سطح الإيثان ، على سبيل المثال ، فإن سرعة الهبوط 1 م / ث تعطي تأخيرا زمنيا قدره 50 مللي ثانية. يتطلب تحقيق تأخيرات زمنية أطول بكثير إجراء مزيد من التعديلات على الإعداد. ملاحظة: بسبب تدفق صفح في منطقة التركيز تدفق الفوهة، ونحن لا نتوقع خلط كبيرة في هذا الجزء من فوهة. بدلا من ذلك، نتوقع أن يحدث الاختلاط أثناء توليد الرش، في قطرات في طريقها إلى الشبكة وأثناء انتشار القطيرات على الشبكة. ويقدر وقت الطيران لرذاذ قطرات للوصول إلى الشبكة ≤ 1 مللي ثانية (لسرعة قطرة من ≥ 10 م / ث ومسافة شبكة فوهة من 1 سم). وبالتالي، فإن الوقت بين هبوط القطيرات والتزجيج هو وحده الذي يعتبر "التأخير الزمني".</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Murphy, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rotary+substates+of+mitochondrial+ATP+synthase+reveal+the+basis+of+flexible+F1-Fo+coupling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Rotary substates of mitochondrial ATP synthase reveal the basis of flexible F1-Fo coupling.</a> Science. 364, (2019).</li>
<li>Benton, D. J., Gamblin, S. J., Rosenthal, P. B., Skehel, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+transitions+in+influenza+haemagglutinin+at+membrane+fusion+pH%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural transitions in influenza haemagglutinin at membrane fusion pH.</a> Nature. , 1-4 (2020).</li>
<li>Dance, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+motion+on+ice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Molecular motion on ice.</a> Nature Methods. , 1-5 (2020).</li>
<li>D'Imprima, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+denaturation+at+the+air-water+interface+and+how+to+prevent+it%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Protein denaturation at the air-water interface and how to prevent it.</a> Elife. 8, 42747(2019).</li>
<li>Noble, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+effects+of+particle+adsorption+to+the+air-water+interface+in+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Reducing effects of particle adsorption to the air-water interface in cryo-EM.</a> Nature Methods. 15, 793-795 (2018).</li>
<li>Klebl, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Need+for+speed%3A+Examining+protein+behaviour+during+cryoEM+grid+preparation+at+different+timescales%5BTitle%5D)+AND+%22BioRxiv%22%5BJournal%5D)">Need for speed: Examining protein behaviour during cryoEM grid preparation at different timescales.</a> BioRxiv. , (2020).</li>
<li>Ravelli, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+structures+from+sub-nl+volumes+using+pin-printing+and+jet+vitrification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM structures from sub-nl volumes using pin-printing and jet vitrification.</a> Nature Communications. 11, 1-9 (2020).</li>
<li>Arnold, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blotting-free+and+lossless+cryo-electron+microscopy+grid+preparation+from+nanoliter-sized+protein+samples+and+single-cell+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Blotting-free and lossless cryo-electron microscopy grid preparation from nanoliter-sized protein samples and single-cell extracts.</a> Journal of Structural Biology. 197, 220-226 (2017).</li>
<li>Razinkov, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+vitrifying+samples+for+cryoEM%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">A new method for vitrifying samples for cryoEM.</a> Journal of Structural Biology. 195, 190-198 (2016).</li>
<li>Feng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fast+and+effective+microfluidic+spraying-plunging+method+for+high-resolution+single-particle+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">A fast and effective microfluidic spraying-plunging method for high-resolution single-particle cryo-EM.</a> Structure. 25, 663-670 (2017).</li>
<li>Ashtiani, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+femtolitre+droplets+using+surface+acoustic+wave+based+atomisation+for+cryo-EM+grid+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Delivery of femtolitre droplets using surface acoustic wave based atomisation for cryo-EM grid preparation.</a> Journal of Structural Biology. 203, 94-101 (2018).</li>
<li>Rubinstein, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shake-it-off%3A+a+simple+ultrasonic+cryo-EM+specimen-preparation+device%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%3A+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Shake-it-off: a simple ultrasonic cryo-EM specimen-preparation device.</a> Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 75, (2019).</li>
<li>Mäeots, M. -E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modular+microfluidics+enables+kinetic+insight+from+time-resolved+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Modular microfluidics enables kinetic insight from time-resolved cryo-EM.</a> Nature Communications. 11, 1-14 (2020).</li>
<li>Kontziampasis, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cryo-EM+grid+preparation+device+for+time-resolved+structural+studies%5BTitle%5D)+AND+%22IUCrJ%22%5BJournal%5D)">A cryo-EM grid preparation device for time-resolved structural studies.</a> IUCrJ. 6, (2019).</li>
<li>Klebl, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+deposition+onto+cryo-EM+grids%3A+from+sprays+to+jets+and+back%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%3A+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Sample deposition onto cryo-EM grids: from sprays to jets and back.</a> Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 76, (2020).</li>
<li>White, H., Thirumurugan, K., Walker, M., Trinick, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+second+generation+apparatus+for+time-resolved+electron+cryo-microscopy+using+stepper+motors+and+electrospray%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">A second generation apparatus for time-resolved electron cryo-microscopy using stepper motors and electrospray.</a> Journal of Structural Biology. 144, 246-252 (2003).</li>
<li>Kaledhonkar, S., Fu, Z., White, H., Frank, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKaledhonkar%2C+S+%22Protein+Complex+Assembly%22">Protein Complex Assembly</a>. , Springer. 59-71 (2018).</li>
<li>Trebbin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+liquid+jet+system+with+compatibility+for+atmospheric+and+high-vacuum+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic liquid jet system with compatibility for atmospheric and high-vacuum conditions.</a> Lab on a Chip. 14, 1733-1745 (2014).</li>
<li>Klebl, D. P., Sobott, F., White, H. D., Muench, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On-grid+and+in-flow+mixing+for+time-resolved+Cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%3A+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">On-grid and in-flow mixing for time-resolved Cryo-EM.</a> Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. , (2021).</li>
<li>He, S., Scheres, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helical+reconstruction+in+RELION%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Helical reconstruction in RELION.</a> Journal of Structural Biology. 198, 163-176 (2017).</li>
<li>Millar, N. C., Geeves, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+limiting+rate+of+the+ATP-mediated+dissociation+of+actin+from+rabbit+skeletal+muscle+myosin+subfragment+1%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">The limiting rate of the ATP-mediated dissociation of actin from rabbit skeletal muscle myosin subfragment 1.</a> FEBS Letters. 160, 141-148 (1983).</li>
<li>Kasas, S., Dumas, G., Dietler, G., Catsicas, S., Adrian, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitrification+of+cryoelectron+microscopy+specimens+revealed+by+high-speed+photographic+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Vitrification of cryoelectron microscopy specimens revealed by high-speed photographic imaging.</a> Journal of Microscopy. 211, 48-53 (2003).</li>
<li>Glaeser, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defocus-dependent+Thon-ring+fading%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Defocus-dependent Thon-ring fading.</a> bioRxiv. , (2020).</li>
<li>Bagshaw, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+beginner%27s+guide+to+flow+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemist%22%5BJournal%5D)">A beginner's guide to flow kinetics.</a> The Biochemist. 42, (2020).</li>
</ol>

يمكن استخدام البروتوكولات في هذا العمل لإعداد الشبكة بسرعة عن طريق الرش المباشر وتجارب TrEM. يمكن استخدام إعداد الشبكة السريعة للحد من تفاعلات الجسيمات مع واجهة مياه الهواء5. القيود الرئيسية هي تركيز العينة المتاحة وسمك الجليد على الشبكة. ضمن هذه الحدود وشريطة أن تكون جودة العينة جيدة، ينتج البروتوكول شبكات مناسبة للكريو-EM عالية الدقة.
استكشاف الاخطاء يحدد معدل تدفق السائل وسرعة الشبكة كمية السائل المودع على الشبكة. مع إعدادات المثال المذكورة أعلاه ...

خلفية وقد مكنت التطورات الأخيرة في المجهر الإلكتروني المبرد (cryo-EM) من إجراء دراسات هيكلية للأنظمة المتزايدة التعقيد بدقة عالية. مع استثناءات قليلة، اقتصرت هذه الدراسات على الجزيئات البيولوجية في التوازن1 أو ردود الفعل بطيئة نسبيا2. تحدث العديد من العمليات في الجسم الحي على مقياس زمني أسرع (مللي ثانية) وهناك اهتمام متزايد في cryo-EM (TrEM) الذي تم حله عبر الزمن على هذه الجداول الزمنية3. ومع ذلك، إعداد عينة cryo-EM التقليدية بواسطة أسلوب النشاف بطيئة جدا لTrEM ميلي ثانية.
أسلوب النشاف له قيود أخرى إلى جانب ضعف الوقت القرار. يمكن أن تعاني البروتينات ومجمعات البروتين من التشبع أو التوجه المفضل على الشبكات4. وقد تبين أن تقليل وقت التعرض لواجهة الهواء والماء أثناء إعداد العينة للتخفيف من التوجه المفضل وتشبع البروتين5،6. وبالتالي، فإن إعداد الشبكة بسرعة لا يتيح فقط TrEM ميلي ثانية ولكن يمكن أيضا تحسين جودة الشبكة.
حاليا، هناك ثلاثة نهج مختلفة لإعداد الشبكة الآلي. يستخدم النهج الأول دبوس أو الشعرية التي تحتوي على كمية صغيرة من العينة. بعد إقامة اتصال بين السائل وسطح الشبكة ، يتم "كتابة" العينة على الشبكة7،8. عملية تطبيق نموذج بطيء نسبيا ويستغرق بضع ثوان. نهج بديل يستخدم توليد القطيرات التي تسيطر عليها موزع بيزو وشبكات الفتل الذاتي9. وهذا يسمح أسرع الاستغناء عن تجميد مرات، ولكن لا يزال محدودا عن طريق سرعة القطيرات والفتل (تصل حاليا إلى 54 مللي ثانية). أسرع نهج حتى الآن هو نهج الرش المباشر ، حيث يتم تفتيت العينة في فوهة رذاذ وقطرات صغيرة (~ 10 - 20 ميكرومتر) وسريعة (&gt; 5 م / ثانية) تنتشر عند ملامسة شبكة cryo-EM. يمكن توليد رذاذ العينة من خلال طرق مختلفة مثل رذاذ الأرومة الهوائية ، والموجات الصوتية السطحية أو المرطبات بالموجات فوق الصوتية10،11،12،13. في تجربتنا، سمك الجليد مع نهج الرش المباشر هو أكبر ولكن الرش المباشر تمكن الاستغناء عن تجميد مرات &lt; 10 مللي ثانية.
يصف هذا البروتوكول خطوة بخطوة كيف يمكن استخدام جهاز EM (TED) الذي تم حله زمنيا والمجهز ب فوهة رذاذ microfluidic لإعداد الشبكات على مقياس زمني سريع14و15. وقد استخدم الجهاز لإعداد الشبكات مع الحد الأدنى من وقت التأخير من 6 مللي ثانية بين تطبيق العينة وتجميد وخلط وتجميد عينات اثنين بسرعة. ويستند تصميم تيد على الإصدار السابق16 ويشبه غيرها من الأجهزة القائمة على رذاذ الوقت حل cryo-EM17.
أولا، يتم وصف الأجزاء الأربعة الرئيسية من إعداد تيد. جوهر تيد هو وحدة المناولة السائلة، وهي المسؤولة عن عينة الطموح والاستغناء. المكبس الهوائي يحرك الشبكة من خلال الرذاذ إلى الإيثان السائل. يتم تحقيق توليد الرذاذ مع فوهات رذاذ microfluidic ويتم التجميد في حاوية الإيثان السائل ، والتي يتم وصفها لفترة وجيزة. وأخيرا، يتم تسليط الضوء على الميزات الإضافية للتحكم في بيئة الشبكة، وخاصة الرطوبة. ويتبع ذلك بروتوكولات مفصلة لتشغيل الجهاز وإجراء تجارب TrEM. يتم إعطاء نتائج تمثيلية لإعداد الشبكة بسرعة وتجربة TrEM بسيطة.
الإعداد التجريبي
وحدة المناولة السائلة يتم تشكيل نظام المناولة السائلة في تيد من خلال ثلاث مضخات محرك حقنة ('مضخات 1 - 3')، كل مجهزة صمام دوار(الشكل 1). توفر إمدادات الطاقة مضخات 1-3 مع 24 فولت DC. الاتصال مع برنامج التحكم (مكتوب في Visual Basic و C ++) عبر واجهة RS232 لضخ 1. يتم توزيع الأوامر من خلال منافذ توسيع الإدخال/إخراج التسلسلية من المضخة 1 إلى المضخات 2-3. مضخات 1-3 مجهزة المحاقن الزجاجية ('المحاقن 1-3'، ونحن نستخدم 250 ميكرولتر / صفر المحاقن حجم الميت هنا). كل صمام له موقفين، "تحميل" و "الاستغناء". يتم استخدام موضع "الحمل" لتنشق العينة في الحقنة. قطعة قصيرة (~ 3 - 4 سم) من 1/16 "O.D., 0.01′′I.D. يتم توصيل أنابيب FEP عبر ETFE / ETFE التجهيزات مع ذلك إلى موقف 'تحميل' من الصمامات 1-3. تصل هذه القطعة القصيرة من الأنابيب إلى خزان العينة (عادة أنبوب بلاستيكي سعة 1.5 مل أو 0.5 مل). موقف "الاستغناء" يؤدي إلى فوهة رذاذ. يتم الاتصال بين منفذ "الاستغناء" وفوهة الرش عن طريق أنابيب PE (~ 20-30 سم طول، 0.043"O.D.، 0.015"I.D.)، مع قطعة قصيرة من أنابيب الأكمام (~ 0.5 سم) و ETFE / ETFE التجهيزات flangeless.
المكبس الهوائي يستخدم TED المكبس الهوائي لتسريع الشبكة وتحريكها من خلال رذاذ العينة في حاوية الإيثان السائلة. ملاقط الضغط السلبي عقد الشبكة، مشدود في حامل المنزل الصنع الذي شنت على اسطوانة هوائية قضيب مزدوج(الشكل 2A).
يتم توفير الضغط من اسطوانة غاز النيتروجين الكبيرة (حجم W) ، ومجهزة منظم متعدد المراحل (0 - 10 بار ، "الضغط الرئيسي"). تربط أنابيب PVC المعززة المرنة (12 مم O.D. ) المنظم بمشعب مكون من 12 منفذا حيث يتم توصيل النيتروجين المضغوط إلى الفوهة والمغطاس الهوائي. تدفق الغاز من خلال فوهة ثابت، وينظم مباشرة في اسطوانة النيتروجين (الضغط الرئيسي). يتم إجراء الاتصال بالزهة مع أنابيب PU (4 مم O.D.، 2.5 مم I.D.)، قطعة قصيرة من أنابيب PE (طول ~ 8 سم، 0.043 بوصة، 0.015 بوصة) والموصلات المناسبة. يتم التحكم في الضغط على المكبس الهوائي من خلال صمام سولينويد. تربط أنابيب PU (4 مم O.D.، 2.5 مم I.D.) الصمام السولينويد بمنظم ومغطاس هوائي، للسماح بانخفاض ضغط الهبوط (≤ الضغط الرئيسي). صمام سولينويد هو الكمبيوتر التي تسيطر عليها. يتم إعطاء نظرة عامة تخطيطية الإعداد في الشكل 2B.
لاحظ أنه مع هذا الإعداد ضغط الهبوط هو دائما على قدم المساواة أو أصغر من ضغط الغاز رذاذ (الضغط الرئيسي). ومع ذلك ، يمكن بسهولة تغيير الإعداد من خلال دمج منظم ثان في المنبع من فوهة الرش للسماح بسرعات هبوط أعلى عند ضغط غاز الرش المنخفض. يمكن أن يؤدي الضغط العالي (&gt;&gt; 2 بار) إلى تلف فوهة رذاذ PDMS.
تنبيه: هذا هو نظام الضغط و "الضغط الرئيسي" يجب أن يكون دائما &lt; 7 بار.
وعادة ما تستخدم الضغوط بين 0.5 و 2 شريط للمغطس الهوائية وتظهر علاقة خطية تقريبا بين الضغط والسرعة (في الموقف الرأسي للرذاذ). يتم قياس سرعات الهبوط مع منظار الذبذبات، متصلة تمشيا مع عداد ال وقوي الشريحة (10 kΩ) وبالتوازي مع مقاوم 2 كيلوΩ (الشكل 2C). توفر إمدادات الطاقة مقياس القوة مع 9 V DC. في حين يتم تعيين سرعة الهبوط التقريبية قبل التجربة عن طريق وضع ضغط الهبوط ، فإن مقياس القوة يعطي قراءات دقيقة للسرعة بعد التجربة.
فوهات الرش وحاوية الإيثان السائلة وقد وصفت تصنيع وتشغيل فوهات افتراضية ديناميكية الغاز لتسليم العينة على أساس رذاذ في مكان آخر بالتفصيل15. كما هو موضح أعلاه، يتم توصيل منافذ "الاستغناء" من الصمامات 1-3 إلى مداخل السائل من فوهة (الشكل 3A). يتم توصيل غاز الرش المضغوط بمدخل الغاز في الفوهة. المداخل في فوهات رذاذ PDMS هي من هذا القبيل أن 0.043 "O.D. PE أنابيب يمكن استخدامها مباشرة دون الحاجة إلى التجهيزات. يحتوي تصميم الفوهة لدينا على هندسة "طائرة نفاثة" لخلط عينتين ، على غرار الجهاز الموصوف في المرجع18. يظهر مخطط للتصميم في الشكل 3B، وتظهر صورة مجهرية لل وفوهة في الشكل 3C. يتطلب تخطيط الجهاز microfluidic استخدام ثلاث حقن لخلط عينتين. يتم وضع فوهة الرش عادة على مسافة 1-1.5 سم من الشبكة (أثناء تطبيق العينة).
نحن نستخدم الإيثان السائل ككريوجين، في وعاء الإيثان السائل / النيتروجين كما هو مستخدم لطريقة النشاف القياسية. يتم تحديد المواقع الرأسية لكأس الإيثان السائل من خلال منصة رفع مختبرية.
التحكم في بيئة الرذاذ والشبكة وترد فوهة المكبس ورذاذ داخل مخصص بنيت PMMA (زجاج الاكريليك) مربع مع باب مزدوج(الشكل 4A). يتم تحقيق الرطوبة النسبية العالية داخل الصندوق من خلال نظام ترطيب الهواء في الجزء الخلفي من تيد(الشكل 4B). يتم توفير الهواء بواسطة مضخة وتغذية في أول 10 "علبة (تستخدم عادة لتنقية المياه تحت بالوعة). تمتلئ العبوة بمستوى منخفض (~ 5-10 سم) من الماء وتضم أيضا وحدة مرطب. يتم التحكم في طاقة التيار الكهربائي للمرطب بواسطة وحدة تحكم رقمية في الرطوبة / درجة الحرارة ومستشعر الرطوبة / درجة الحرارة الموجود داخل صندوق زجاج الأكريليك. يتم تعيين وحدة التحكم لإيقاف تشغيل المضخة عندما تصل الرطوبة النسبية ≥ 90 ٪. يتم ضخ الهواء المرطب من العبوة الأولى من خلال الناشر ، مغمورة في الماء في عبوة 10 بوصة ثانية ثم تدخل مربع زجاج الأكريليك.
تنبيه: نظرا لأن العينة يتم هباءها في فوهة الرش ، فإن العينة البيولوجية أو الكيميائية الخطرة ليست مناسبة كعينات.
تسلسل التشغيل يبدأ الزر تشغيل البرنامج النصي في برنامج التحكم تسلسل التشغيل. يمكن تعريف تسلسل الأوامر هذا مسبقا في ملف البرنامج النصي وتغييره من خلال البرنامج. يتم شرح أهم المتغيرات هنا:
سرعة الرش: تحدد سرعة الرش معدل التدفق السائل الذي تستخدمه مضخة الحقنة. يمكن حساب معدل التدفق على النحو التالي: محركات مضخة الحقن المستخدمة هنا لها حجم خطوة ثابتة. وتنقسم المجموعة الكاملة للمضخة إلى 48،000 خطوة. العامل الثاني المهم هو حجم الحقنة. نحن عادة ما نستخدم 250 حقنة ميكرولتر. يتم تعيين سرعة الرش في برنامج التحكم وعدد من الخطوات / الثانية. سرعة الرش من 1000 خطوات / ثانية يتوافق مع:
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62199/62199eq01.jpg">
حجم الرش: يحدد حجم الرش إجمالي الحجم الذي سيتم رشه. وهكذا، فإنه يحدد أيضا مدة رذاذ. يتم تعيين حجم الرش في برنامج التحكم كعدد من الخطوات. حجم رذاذ من 2000 خطوات، بسرعة رذاذ من 1000 خطوة / ثانية، ويؤدي إلى مدة رذاذ من 2 ق وحجم إجمالي قدره 10.4 ميكرولتر.
وقت ما قبل الرش: يحدد هذا المتغير الوقت بين بدء الرش والغطس. من المهم اختيار وقت التأخير بحيث يكون للرذاذ الوقت الكافي لتحقيق الاستقرار قبل إغراق الشبكة. عادة، يتم إعطاء رذاذ 1.5 -4 ق لتحقيق الاستقرار قبل أن تغرق الشبكة. يتم الحفاظ على الرذاذ حتى تتحرك الشبكة من خلال. عادة، يتم إيقاف تدفق السائل (وبالتالي رذاذ) 0.5 إلى 1 s بعد أن تم هوت الشبكة. باستخدام سرعة رش 1000 خطوة / ثانية وحجم رذاذ من 2000 خطوة ، فإن وقت الرش النموذجي هو 1.5 ثانية ، على سبيل المثال.
يظهر تسلسل مثالي للأوامر في الشكل 5A، ويتم توضيح موضع الشبكة بمرور الوقت في الشكل 5B.

<table><tbody><tr><td><قوي > الوقت تم حل الجهاز < / قوي ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>صندوق زجاجي أكريليك</td><td>الولايات المتحدة الأمريكية تحكم</td> في الرطوبة / درجة الحرارة الرقمية <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>THE20 جهاز التحكم</td><td></td><td></td>في الرطوبة / درجة الحرارة الرقمي</tr> قضيب مزدوج <tr><td>اسطوانة هوائية</td> قضيب مزدوج <td>أسطوانة هوائية TN 10x70</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FEP الأنابيب</td><td>أب تشيرش العلمية 1/16 " OD ، 0.01 '' ID. FEP الأنابيب بدون</td><td></td><td></td></tr><tr><td>حواف تجهيزات</td><td>Upchurch Scientific ETFE / ETFE بدون حواف أنابيب</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PVC مقوى</td><td>مرنة 12 مم OD. محاقن زجاجية</td><td></td><td></td>مرنة مقوى بأنابيب</tr><tr><td></td><td>PVC Kloehn 250 & micro ؛ </td> L مضخة ترطيب الحجم <td></td><td></td>صفر ميتة</tr> تفسير <tr><td>حاوية الإيثان السائل</td> Aqua Air AP3 <td></td> من Thermo / FEI VitrobotTM منظم مارك الرابع <td></td><td></td></tr><tr><td>متعدد المراحل</td><td>GASARC من الفئة 3 منظم متعدد المراحل</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ملاقط الضغط السلبي</td><td>Dumont N5 Inox B ملاقط</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td> الضغط السلبي <td></td><td></td></tr><tr><td>راسم الذبذبات</td><td>Hantek 6022BE راسم</td><td></td><td></td>الذبذبات</tr><tr><td>PE أنابيب</td><td>Scientific Commodities Inc. 0.043 " OD ، 0.015 " ID.</td><td></td><td></td></tr> PE <tr><td>أنبوب امدادات</td><td>الطاقة يعني جيدا GSM160A24-R7B</td><td></td><td></td></tr><tr><td>امدادات الطاقة</td><td>Wanptek KPS305D امدادات</td><td></td><td></td>الطاقة</tr><tr><td>أنابيب PU</td><td>SMC TU0425 4 مم OD ، 2.5 مم هوية PU منظم الأنابيب</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Norgren R72G-2GK-RMN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>مقياس الجهد</td><td>المنزلق PS100 الشريحة</td><td></td><td></td></tr><tr><td>صمام الملف اللولبي</td><td>SMC NVJ314M مضخات محرك الحقنة صمام</td><td></td><td></td>الملف اللولبي</tr><tr><td>Kloehn V6 48K نموذج</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>< قوي > الكواشف & المواد< / قوي ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>apoferritin من طحال الخيول</td><td>Sigma-Aldrich ، A3660</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich ، A2383</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cryo-EM شبكات</td><td>Quantifoil 300 شبكة Cu ، R 1.2 / 1.3</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma Aldrich E3889</td><td></td><td></td></tr><tr><td>F-actin</td><td>مقدمة من H.D. وايت (لإجراء التحضير ، انظر المرجع 1)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>تفريغ التوهج</td><td>Cressington 208 طلاء الكربون مع وحدة</td><td></td><td></td>تفريغ التوهج</tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich ، H7006</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KAc</td><td>Sigma-Aldrich ، P1190</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgCl 2</td> <td>Sigma-Aldrich ، M8266</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma-Aldrich ، M1254</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich ، S9888</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ميوسين العضلات الهيكلية S1</td><td>مقدم من H.D. وايت (لإجراء التحضير ، انظر المرجع 2)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>المرجع 1</td><td>Spudich ، J. A. & amp وات ، س. تنظيم تقلص عضلات الهيكل العظمي للأرانب I. الدراسات الكيميائية الحيوية لتفاعل مركب تروبوميوسين تروبونين مع الأكتين والشظايا المحللة للبروتين من الميوسين. مجلة الكيمياء البيولوجية 246, 4866-4871 (1971).</td><td></td><td></td></tr><tr><td>المرجع 2</td><td>وايت ، ح. & أمبير تايلور ، E. Energetics وآلية أكتوميوسين أدينوسين ثلاثي فوسفاتيز. biochemistry 15 ، 5818-5826 (1976).</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

إعداد الشبكة السريعة للمجهر cryo-electron الذي تم حله زمنيا

Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy

يتطور مجال المجهر الإلكتروني المبرد (cryo-EM) بسرعة باستخدام أجهزة جديدة وخوارزميات معالجة ، مما ينتج هياكل عالية الدقة ومعلومات عن الأنظمة الأكثر تحديا. ويخضع إعداد العينة للكريو-م لثورة مماثلة مع وضع نهج جديدة لتحل محل أنظمة النشاف التقليدية. وتشمل هذه استخدام موزعات بيزو الكهربائية، دبوس الطباعة والرش المباشر. ونتيجة لهذه التطورات، تسير سرعة إعداد الشبكة من ثوان إلى مللي ثانية، مما يوفر فرصا جديدة، لا سيما في مجال التبريد-EM الذي تم حله زمنيا حيث يمكن خلط البروتينات والركائز بسرعة قبل الهبوط في التجمد، مما يؤدي إلى محاصرة الدول المتوسطة قصيرة العمر. هنا نقوم بوصف، بالتفصيل، بروتوكول قياسي لصنع شبكات على جهاز EM الداخلي الذي تم حله زمنيا لإعداد الشبكة السريعة القياسية وكذلك للتجارب التي تم حلها زمنيا. يتطلب البروتوكول عينة لا تقل عن 50 ميكرولتر بتركيزات ≥ 2 ملغم/مل لإعداد 4 شبكات. يمكن أن يكون التأخير بين تطبيق العينة والتجميد منخفضا إلى 10 مللي ثانية. أحد القيود هو زيادة سمك الجليد بسرعات أسرع ومقارنتها بطريقة النشاف. نأمل أن يساعد هذا البروتوكول الآخرين في تصميم أجهزة صنع الشبكة الخاصة بهم والمهتمين بتصميم تجارب حلها الزمن.

إعداد الشبكة بسرعة مع TED كعينة اختبار لإعداد الشبكة السريعة ، استخدمنا أبوفريتين من طحال الخيول بسرعة 20 ميكرومتر في 30 mM HEPES ، 150 mM NaCl ، درجة الحموضة 7.5. تم الحصول على إعادة بناء في القرار 3.5 ألف من 690 ميكروجراف كما هو موضح في المرجع15 (الشكل 7A). تم اختيار نطاق defocus بحيث يمكن التعرف بسهولة على الجسيمات في الصور الخام(الشكل 7B). تظهر الشبكة النموذجية المعدة مع تأخير زمني من 10-40 مللي ثانية مساحات كافية ...

هنا، نقدم بروتوكول مفصل لاستخدام جهاز صنع الشبكة السريعة لكل من صنع الشبكة السريعة والاختلاط السريع والتجميد لإجراء تجارب حل الوقت.

إعداد الشبكة السريعة للمجهر Cryo-Electron الذي تم حله زمنيا

The field of cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly developing with new hardware and processing algorithms, producing higher resolution structures ...

مرحبا، ومرحبا بكم في هذا الفيديو JoVE". نريد أن نقدم لكم الإعداد الذي لدينا هنا لصنع الشبكة السريعة، دراسة حلها الزمن التي نحن تطوير أكثر في ليدز. كن على علم بأن هذا ليس نظاما قياسيا ، ولكننا نأمل أنه من خلال إعطائك سردا مفصلا لجميع الأشياء والمعلمات التي نقوم بها ، ستتمكن من تطوير أنظمة مماثلة في مختبراتك الخاصة.ويرد وصف مفصل للجهاز في بروتوكول ريتشموند. هنا، نحن ذاهبون لإعطاء دليل خطوة بخطوة لإعداد الشبكة بسرعة وEM حل الوقت. في تجربتنا، يجب أن يكون تركيز البروتين اثنين ملليغرام لكل ملليلتر أو أعلى. يتطلب البروتوكول حدا أدنى من الحجم يبلغ حوالي 50 ميكرولتر.قم بتشغيل الجهاز. ثم قم بتشغيل جهاز التحكم وبدء تشغيل برنامج التحكم. تهيئة جميع مضخات الحقنة عن طريق الضغط على زر التهيئة على كل مضخة حقنة.قم بتشغيل مصدر الطاقة القوي، واضبطه على تسع فولتات، وابدأ تشغيل برنامج التحكم في الذبذبات. هناك حاجة إلى غاز النيتروجين المضغوط لتوليد رذاذ. فتح اسطوانة النيتروجين وتعيين الضغط إلى 2 شريط.تأكد من أن جميع صمامات مضخة المحاقن في وضع الحمل. للقيام بذلك، قم بتبديل كافة الصمامات للاستغناء في برنامج التحكم ومن ثم العودة إلى التحميل. تعيين جميع المحاقن إلى الصفر.وينبغي إزالة أي فقاعات الهواء الموجودة في النظام في هذه المرحلة. للقيام بذلك قد يكون المحاقن فك، فقاعات إزالتها يدويا، والمحاقن التي شنت مرة أخرى عند احتواء لا مزيد من الفقاعات. عادة ما يتم تخزين نظام المناولة السائلة في الماء.قبل تحميل العينة، يتم دقة النظام مع المخزن المؤقت. ويتم ذلك عن طريق غسل الأنابيب مع فائض من العازلة. ضع أنبوب يحتوي على ما لا يقل عن 200 ميكرولتر من العازلة على حقنة واحدة.يجب أن تكون مثقوبة الجزء العلوي من الأنبوب لإرفاقه. يستنشق كمية مناسبة من العازلة، بين 50 و 100 ميكرولتر مع حقنة واحدة باستخدام برنامج التحكم. تبديل صمام واحد للاستغناء.الاستغناء عن كل من السائل في حقنة واحدة. عودة صمام واحد إلى موقف الحمل، واضغط على زر تهيئة على حقنة واحدة لإعداد النظام لدورة الغسيل المقبل. وعادة ما تتكرر هذه الخطوات ثلاث مرات لضمان غسل شامل للأنابيب.بعد ذلك ، يتم وضع فوهة الرش. ضع شبكة EM في الذراع المنغمسة. ضع الشبكة أمام فوهة الرش.الاستغناء عن المخزن المؤقت باستخدام برنامج التحكم. إذا تم محاذاة الفوهة والشبكة ، يجب أن يتراكم السائل بعد الرش لفترة طويلة من الزمن. إذا لزم الأمر، قم بضبط موضع الفوهة ثم تحقق مرة أخرى من مكان تراكم السائل على الشبكة.بعد ذلك، ضبط موقف كأس الإيثان. يجب أن تصل أطراف الملاقط إلى مركز كأس الإيثان تقريبا. قم بإجراء اختبار للتأكد من صحة كافة الإعدادات.أغلق غرفة الرطوبة. تأكد من أن مسار المكبس واضح. يستنشق حجم المخزن المؤقت المطلوب لتشغيل واحد في حقنة واحدة.تبديل صمام واحد للاستغناء. بدء التشغيل بالضغط على run'in برنامج التحكم. تحقق من أن مضخة حقنة واحدة تتحرك، ثانيتين في هذه الحالة، ويتم هوت الشبكة بعد تأخير مناسب، 1.5 ثانية هنا.عند الانتهاء من تشغيل، تعيين الضغط على ذراع المكبس إلى القيمة المطلوبة. اضغط OK'in برنامج التحكم لتحرير الضغط من الذراع يغرق. الآن كأس الإيثان بارد ومليء بال إيثان السائل.توهج التفريغ الشبكات قبل الاستخدام. وتوهج نموذجي التفريغ هو 90 ثانية في 10 مللي أمبير في الهواء 0.1 ملليبار. ثم يتم توازن الأنابيب مع العينة.إذا كان حجم العينة المتوفرة منخفضا، فقد يتم إعادة توازن الأنابيب بحجم واحد فقط. عينة أسبيرات. عادة ما يكون حجم الميت حوالي 30 ميكرولتر.تبديل صمام واحد للاستغناء. الاستغناء عن العينة من خلال الأنابيب وفوهة. ثم يستنشق مقدار العينة المطلوبة لتشغيل واحد.تبديل صمام واحد للاستغناء. تأكد من أن الرطوبة النسبية قد وصلت إلى القيمة المطلوبة. نحن عادة إعداد الشبكات في 60٪ أو أعلى.هذا يمكن أن يستغرق بضع دقائق. ضع الملاقط التي تحمل شبكة متوهجة في الذراع المنغمسة. ضع الشريحة قياس القوة في موضع البداية، وعلى استعداد لقياس السرعة.تعيين المشغل لقياس السرعة في برنامج الذبذبات. ضع كوب الإيثان السائل، وعلى مقربة من غرفة الرطوبة. تأكد من أن مسار المكبس واضح.بدء التشغيل في برنامج التحكم. عند الانتهاء من تشغيل، اضغط OK'in برنامج التحكم للافراج عن الضغط من الذراع يغرق. فتح غرفة الرطوبة، وتخفيف الصلة بين الذراع يغرق وملاقط.تحريك الذراع يغرق مع الحفاظ على الشبكة في الإيثان السائل. ثم نقل الشبكات إلى النيتروجين السائل وإلى التخزين. حفظ قياس الذبذبات.يدويا إعادة تعيين موقف شريط التمرير عداد القوة والغطاس. كرر البروتوكول لإعداد الشبكات المتماثلة. ويتم إجراء التجارب التي تم حلها زمنيا بطريقة مماثلة.هناك حاجة إلى تركيزات أعلى للمخزون للتجارب التي تم حلها زمنيا بسبب التخفيف في خطوة الاختلاط. لإجراء تجربة تم حلها زمنيا، استخدم جميع المحاقن الثلاث. يتم إرفاق أنابيب لمضخات الحقنة وفوهة رذاذ.فوهة رذاذ microfluidic المستخدمة هنا يحتوي أيضا على عنصر خلط. لاحظ أن أنابيب أطول سوف تعطي أكبر الميت الحجم وغسل خطوات التوازن تتطلب المزيد من العازلة وعينة. توازن جميع المحاقن مع العازلة وعينة على حدة.عادة، يتم استخدام حقنة واحدة لعينة A'and المحاقن اثنين وثلاثة وتستخدم لعينة B'After الأنابيب هو متساوية، تحميل عينة A في حقنة واحدة وعينة B في المحاقن اثنين وثلاثة. ثم قم بتبديل الصمامات من واحد إلى ثلاثة للاستغناء عنها. بدء التشغيل في برنامج التحكم.لاحظ أن هناك حاجة إلى برنامج نصي تشغيل مختلفة لتجربة حل الوقت. ويمكن تحقيق تأخيرات زمنية مختلفة بطريقتين. عن طريق ضبط سرعة المكبس، يمكن تغيير تأخير الوقت من الاختلاط إلى التجميد.سرعة الهبوط الأسرع ستؤدي إلى تأخير أقصر في الوقت. بدلا من ذلك، يتم تغيير مسافة الإيثان رذاذ عن طريق ضبط الموقف الرأسي للرذاذ فوهة. زيادة المسافة سيؤدي إلى تأخير وقت أطول.في المجهر الإلكتروني عند التكبير المنخفض ، تبدو الشبكة النموذجية مثل هذا. مناطق الجليد الرقيقة، كما هو مبين، مناسبة للحصول على البيانات. في التكبير الأعلى، يجب أن تكون الجسيمات مرئية بوضوح.مع عينة اختبار مثل أبوفيريتين، مجموعة بيانات صغيرة نسبيا من شبكة واحدة كافية لإعادة الإعمار في دقة angstrom ثلاثة إلى أربعة. بالنسبة للتجارب التي تم حلها زمنيا، نقوم بتجميع مجموعات البيانات من نقاط أو شبكات زمنية مختلفة. من المفيد الجمع بين البيانات لتصنيف ثلاثي الأبعاد ومن ثم تتبع الجسيمات إلى نقاطها الزمنية.وبهذه الطريقة يمكن أن توفر البيانات معلومات هيكلية ومعلومات عن الحركية رد الفعل. في الختام، نأمل أن تكونوا قد استمتعتم بالفيديو. نأمل أنه مع الأوصاف التفصيلية في ورقة JoVE جنبا إلى جنب مع الفيديو ، ستتمكن من إجراء تجاربك الخاصة عبر صنع الشبكة السريعة ، والتي ثبت أنها تخفف من بعض المشاكل الناجمة عن الطفرة أو المساعدة في التفاعلات في واجهة الهواء والماء ، كل ما تحتاجه لإجراء دراساتك الخاصة التي تم حلها زمنيا لمحاولة اعتراض بعض حالات عدم التوازن هذه.لذا، صنع شبكة سعيدة.

fast-grid-preparation-for-time-resolved-cryo-electron-microscopy

Research

JoVE Journal

Biochemistry

الكيمياء الحيوية

نقدم بروتوكول بشأن كيفية الاستفادة من الإنتاجية العالية التصوير المقطعي البرد الإلكترون لتحديد دقة عالية في هياكل الموقع من الآلات الجزيئية. يسمح البروتوكول كميات كبيرة من البيانات التي سيتم تجهيزها، ويتجنب الاختناقات المشتركة، ويقلل من وقت التوقف عن العمل الموارد، مما يتيح للمستخدم التركيز على المسائل البيولوجية الهامة.

باستخدام Tomoauto: بروتوكول لإنتاجية عالية الآلي البرد الإلكترون التصوير المقطعي

وترد أداة وأساليب لإعداد مجلدات الحجم نانولتر عينة مجهر إلكتروني. أية خطوات ورقة النشاف مطلوبة، وبالتالي تجنب العواقب الضارة وهذا يمكن أن يكون للبروتينات، إلى حد كبير الحد من فقدان عينة وتمكين تحليل خلية مفردة ليساتي البروتيوميات البصرية.

إعداد عينة المنمنمة مجهر إلكتروني

يصف البروتوكول المعروض هنا استخدام Spotiton ، وهو نظام روبوتي جديد ، لتقديم عينتين من الاهتمام على شبكة نانوية ذاتية الفتل تختلط لمدة لا تقل عن 90 مللي ثانية قبل التزجيج في cryogen السائل.

إعداد الشبكة المجهرية كريو إلكترون للدراسات التي تم حلها عبر الزمن باستخدام نظام روبوتي جديد، Spotiton

أصبح تحديد هيكل المجمعات الجزيئية الكبيرة باستخدام cryoEM روتينيا لفئات معينة من البروتينات والمجمعات. هنا، يتم تلخيص هذا الخط (إعداد العينات، والفحص، والحصول على البيانات ومعالجتها) ويتم توجيه القراء نحو المزيد من الموارد التفصيلية والمتغيرات التي يمكن تغييرها في حالة العينات الأكثر تحديا.

المجهر أحادي الجسيمات كريو إلكترون: من عينة إلى هيكل

توفر هذه الورقة بروتوكولا مفصلا لإعداد شبكات العينات عند درجات حرارة تصل إلى 70 درجة مئوية، قبل التجمد الغاطس لتجارب التبريد الكهرومغناطيسي.

إعداد شبكات عينات ذات درجة حرارة عالية ل Cryo-EM

هنا ، نقدم خط أنابيب لطحن شعاع الأيونات المركز 3D على توجيه إعداد العينات الخلوية للتصوير المقطعي الإلكتروني بالتبريد. يتم تحديد موقع 3D للبروتينات الموسومة بالفلورسنت ذات الأهمية أولا بواسطة الفحص المجهري الفلوري بالتبريد ، ثم يتم استهدافه للطحن. البروتوكول مناسب للثدييات والخميرة والخلايا البكتيرية.

إعداد العينة بواسطة طحن شعاع الأيونات المركز 3D للتصوير المقطعي عالي الدقة للإلكترون بالتبريد

الهدف من هذا البروتوكول هو توجيه التصاق الخلايا ونموها إلى المناطق المستهدفة من الشبكات للفحص المجهري الإلكتروني المبرد. ويتحقق ذلك من خلال تطبيق طبقة مضادة للقاذورات يتم استئصالها في أنماط محددة من قبل المستخدم متبوعة بترسب بروتينات المصفوفة خارج الخلية في المناطق المنقوشة قبل بذر الخلايا.

شبكات المجهر الإلكتروني للإرسال بالنمط المجهري لتحديد مواقع الخلايا مباشرة ضمن سير عمل التصوير المقطعي بالتبريد والإلكترون للخلية الكاملة

يمكن أيضا تحقيق خرائط cryo-EM عالية الدقة للجزيئات الكبيرة باستخدام مجاهر TEM 200 kV. يعرض هذا البروتوكول أفضل الممارسات لوضع محاذاة بصريات دقيقة ، ومخططات الحصول على البيانات ، واختيار مناطق التصوير التي تعد جميعها ضرورية للجمع الناجح لمجموعات البيانات عالية الدقة باستخدام TEM 200 كيلو فولت.

الجمع الروتيني لمجموعات بيانات التبريد EM عالية الدقة باستخدام المجهر الإلكتروني الناقل 200 كيلو فولت

نصف هنا بروتوكولا لاستخراج التوبولين الداخلي من خلايا الثدييات، التي يمكن أن تفتقر إلى إنزيمات محددة معدلة للأنابيب الدقيقة أو تحتوي عليها، للحصول على أنابيب دقيقة مخصبة لإجراء تعديل معين. ثم نصف كيف يمكن تزيين الأنابيب الدقيقة المستخرجة ببروتينات مرتبطة بالأنيبيبات الدقيقة المنقاة لإعداد شبكات للمجهر الإلكتروني بالتبريد.

استخراج الأنابيب الدقيقة المعدلة من خلايا الثدييات لدراسة معقدات بروتين الأنابيب الدقيقة بواسطة المجهر الإلكتروني بالتبريد

توفر هذه الطريقة بروتوكولا مرنا يسهل الوصول إليه لإعداد شبكات المجهر الإلكتروني (EM) للتصوير بالتبريد الخلوي في الموقع والمجهر الضوئي والإلكتروني المرتبط (CLEM).

تحضير العينة للتصوير بالتبريد في الموقع لخلايا الثدييات

اكتشف بروتوكول إعداد الشبكات السريع للمجهر الإلكتروني المبرد المُحلّل زمنياً باستخدام جهاز مخصص. يتيح هذا الأسلوب التقاط الحالات الوسيطة العابرة للبروتينات بدقة زمنية تصل إلى 10 مللي ثانية.

إعداد الشبكة السريعة للمجهر Cryo-Electron الذي تم حله زمنيا

استكشف المزيد من الفيديوهات