في الوقت الحقيقي داخل المجهرية متعددةفوتون لتصور الموجات فوق الصوتية المركزة والعلاجات Microbubble لزيادة نفاذية حاجز الدم في الدماغ
فبراير 5, 2022
يصف هذا البروتوكول الإجراءات الجراحية والتقنية التي تمكن التصوير الفلوري متعدد الفوتونات في الجسم الحي لدماغ القوارض أثناء علاجات الموجات فوق الصوتية والفقاعات الدقيقة المركزة لزيادة نفاذية حاجز الدم في الدماغ.
وقد برز التعرض بالموجات فوق الصوتية في وجود microbubbles كوسيلة فعالة لزيادة عابر ومحلي نفاذية حاجز الدم في الدماغ. عادة ما يعوق حاجز الدم في الدماغ تسليم الأدوية المحتملة لعدة أمراض في الدماغ. عند سونيكيشن، تبدأ الفقاعات الدقيقة المحقونة في التذبذب وتحفز الضغط على جدار السفينة، وفتح تقاطعات ضيقة والسماح في نهاية المطاف للأدوية بعبور حاجز الدم في الدماغ في النماذج قبل السريرية، وغالبا ما تتم دراسة تأثير الموجات فوق الصوتية وعلاج الفقاعات الدقيقة عن طريق التصوير بالرنين المغناطيسي المعزز على النقيض من ذلك أو من خلال دراسة البذخ من الأصباغ ex vivo.
العيب من هذا النهج هو أن الاستجابة في الوقت الحقيقي أثناء وبعد التعرض مباشرة بالموجات فوق الصوتية لا يمكن الحصول عليها. التصوير متعدد الفوتون داخل الدماغ يعطي الفرصة لدراسة هذه الآثار في الوقت الحقيقي. في الفيديو التالي، سوف نقدم تعليمات خطوة حول كيفية وضع نافذة الجمجمة في الماوس وإجراء العلاج الموجات فوق الصوتية microbubble باستخدام محول حلقة محمولة على الجمجمة.
هذا الإجراء يتيح سونيكيشن المتزامنة وفي التصوير متعدد الفوتون في الجسم الحي. للبدء في إعداد المواد اللازمة لجراحة نافذة الجمجمة وعلاجات الفقاعات الدقيقة بالموجات فوق الصوتية. في هذا الفيديو، نعرض جراحة حادة في نافذة الجمجمة غير قابلة للشفاء.
لجراحة نافذة الجمجمة الانتعاش المزمن، والأدوات والمواد المعقمة، ومساحة جراحية معقمة، والأدوية المناسبة ضرورية. قبل الجراحة إدارة التخدير والتسكين. إزالة الفراء على رأسه.
ضع الحيوان في إطار ستيريوتاكسيك. أدخل قسطرة في الوريد الذيل لحقن الدكستران والفقاعات الدقيقة. الحفاظ على درجة حرارة الحيوان الأساسية من 37 درجة باستخدام مصدر الحرارة.
هنا نحن نستخدم قفاز مملوء بالماء الدافئ. لإزالة فروة الرأس، ارفع الجلد بين العينين باستخدام ملقط وقطع على طول خياطة القوس. إزالة periosteum تغطي السطح الخارجي للجمجمة مع مسحة القطن.
بعد ذلك وضع علامة على الموقع المطلوب من النافذة الجمجمة على الجمجمة والبدء في الحفر على طول المخطط التفصيلي. لمنع الجمجمة من ارتفاع درجة الحرارة أثناء الحفر، بالتنقيط المالحة على الجمجمة باستخدام حقنة أو تطبيق قطعة من الإسفنج الجراحي غارقة في المالحة. بالتناوب بين الحفر وتبريد الجمجمة.
تحقق من تقدم الحفر عن طريق تطبيق ضغط لطيف على جزيرة العظام. إزالة جزيرة العظام باستخدام زوج من ملقط. تأكد من أن الدماغ يبقى رطبا باستخدام قطعة من الإسفنج الجراحي الذي تم presoaked في المالحة.
لوضع نافذة الجمجمة، ضع قطرة من المالحة على جانب واحد من غطاء والمناورة على ثقب في الجمجمة. نشر طبقة من الغراء حول محيط غطاء لإرفاقه إلى الجمجمة. مرة واحدة في الغراء جافة تماما، وإيداع محلول agarose على النافذة ووضع محول على القمة.
تطبيق ضغط ثابت بحيث يكون هناك الحد الأدنى من الآغاروز بين محول ونافذة الجمجمة. عندما يبرد الآغروز إلى اتساق يشبه الهلام ، اقطع الآغاروز الزائد من محيط غطاء المحول. نشر طبقة من الغراء على طول محيط غطاء محول لتلتصق به إلى الجمجمة.
بعد أن يجف الغراء تماما ، ضع الحيوان تحت العدسة الموضوعية للمجهر. تأكد من أن الهدف لا يصطدم مع محول أو غطاء. حدد مجال الرؤية في المجهر متعدد الفوتون.
إعداد مسح التصوير من الأوعية الدموية والبدء سونيكيشن. لهذا البروتوكول، نستخدم محول حلقة التي يتم تشغيلها على تردد القيادة من 0.82 ميغاهيرتز، 10 مللي ثانية دورات فهرستها ميكانيكيا من 0.2 إلى 0.4، وترددات تكرار النبض بين واحد وأربعة هيرتز. يتم حقن الفقاعات الصغيرة سونوفيو بجرعة ملليلتر واحد للكيلوغرام الواحد.
يمكن الكشف عن علاجات الفقاعات الدقيقة الناجحة بالموجات فوق الصوتية عن طريق البذخ من الدكستران الفلوري من داخل الأوعية الدموية إلى الفضاء خارج الأوعية الدموية ، مما يشير إلى زيادة في نفاذية BBB. لتقييم الحركية من تسرب dextran كنموذج تمثيلي لتسليم المخدرات، وكثافة إشارة بين المساحات داخل وخارج الأوعية الدموية يمكن تقييمها باستخدام أدوات مثل MATLAB. لتقييم التغيرات الوعائية الناجمة عن علاجات الفقاعات الدقيقة بالموجات فوق الصوتية ، يمكن قياس قطر السفينة ذات الاهتمام قبل وأثناء وبعد علاج الفقاعات الدقيقة بالموجات فوق الصوتية.
يمكن إجراء تحليل الصور باستخدام برامج مثل ImageJ أو FIJI أو أدوات البرمجة. هنا تم استخدام Imaris لتقسيم الأوعية الدموية وتصنيفها. يوفر الفحص المجهري متعدد الفوتون داخل الدماغ جنبا إلى جنب مع محولات الحلقة طريقة لرصد الآثار الناجمة عن علاج الفقاعات الدقيقة بالموجات فوق الصوتية في الوقت الحقيقي بدقة مكانية وزمنية عالية.
ويمكن الحصول على بيانات كمية ونوعية لدراسة، على سبيل المثال، حركية البذخ والتغيرات الوعائية. يمكن تطبيق الطريقة التجريبية المعروضة هنا على العديد من نماذج البحث وعلى تطبيقات الموجات فوق الصوتية المختلفة.
نظرة عامة
يوضح هذا البروتوكول إجراءات التصوير الفلوري متعدد الفوتونات في الجسم الحي وبزمن حقيقي لدماغ القوارض أثناء العلاج بالموجات فوق الصوتية المركزة والفقاعات الدقيقة. تهدف هذه التقنية إلى تعزيز نفاذية الحاجز الدموي الدماغي، مما يسهل إيصال الأدوية لعلاج أمراض الدماغ.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- الهندسة الطبية الحيوية
- تقنيات التصوير
خلفية علمية
- يمكن للموجات فوق الصوتية والفقاعات الدقيقة زيادة نفاذية الحاجز الدموي الدماغي بشكل مؤقت.
- تسمح هذه الطريقة بتحسين إيصال الدواء إلى الدماغ.
- لا تتيح طرق التصوير التقليدية رصد الاستجابات في الوقت الفعلي أثناء العلاج.
- يوفر التصوير متعدد الفوتونات داخل الجسم الحي حلاً للمراقبة في الوقت الفعلي.
الغرض من الدراسة
- لتوضيح بروتوكول للمعالجة بالموجات فوق الصوتية والتصوير متعدد الفوتونات بشكل متزامن.
- لتمكين المراقبة في الوقت الفعلي للتغيرات في نفاذية الحاجز الدموي الدماغي.
- لتقييم فعالية طرق توصيل الأدوية في النماذج قبل السريرية.
الطرق المستخدمة
- تحضير النافذة القحفية في الفئران من أجل التصوير.
- استخدام محول طاقة حلقي لتطبيق الموجات فوق الصوتية.
- حقن الفقاعات الدقيقة والديكستران الفلوري لأغراض التصوير.
- التصوير في الوقت الحقيقي للتغيرات الوعائية أثناء العلاج.
النتائج الرئيسية
- التصوير الناجح للتغيرات في نفاذية الحاجز الدموي الدماغي.
- التحليل الكمي لتسرب الديكستران كنموذج لإيصال الدواء.
- المراقبة في الوقت الحقيقي للاستجابات الوعائية للعلاج بالموجات فوق الصوتية.
- تحقيق دقة مكانية وزمنية عالية في التصوير.
الاستنتاجات
- يتيح هذا البروتوكول التصوير الفعال في الوقت الحقيقي لدماغ القوارض.
- يمكن أن يعزز العلاج بالفقاعات الدقيقة للموجات فوق الصوتية إيصال الأدوية عبر الحاجز الدموي الدماغي.
- يمكن تطبيق هذه الطريقة على نماذج بحثية وتطبيقات مختلفة للموجات فوق الصوتية.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
يتيح المجهر متعدد الفوتونات الحيوي في الوقت الحقيقي التصوير المباشر للتغيرات في نفاذية الحاجز الدموي الدماغي الناتجة عن الموجات فوق الصوتية المركزة والفقاعات الدقيقة، مما يعالج عقبة حرجة في إيصال الأدوية إلى الجهاز العصبي المركزي. يوفر هذا النهج قراءات كمية وديناميكية لنفاذية الأوعية الدموية وحركية الارتشاح، مما يدعم تقليل المخاطر الميكانيكية لاستراتيجيات الإيصال بوساطة الموجات فوق الصوتية. ومن خلال تقديم العلاج والتصوير بشكل متزامن، تعزز هذه الطريقة الثقة التنبؤية في سير عمل التحقق من الأهداف قبل السريرية وتحسين المركبات الرائدة.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الصيدلة الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: تتيح استقصاء الفرضيات العلاجية من خلال المراقبة المباشرة لآليات الموجات فوق الصوتية والفقاعات الدقيقة وتأثيرها على سلامة الأوعية الدموية داخل الجسم الحي.
- القيمة التشغيلية: تدعم التحقق من الأهداف الوظيفية من خلال الربط في الوقت الفعلي بين معاملات السونيكة ونتائج نفاذية الحاجز.
- القيمة التنبؤية: تسهل عملية فرز محفظة المشاريع عن طريق قياس تسرب الديكستران كمؤشر بديل لكفاءة إيصال الدواء عبر نماذج الحاجز الدموي الدماغي (BBB).
الفحص وتطوير المقايسة
- جاهزية المقايسة: تعمل على تحضير أنظمة بيولوجية معيارية لتقييم المركبات اللاحقة من خلال وضع ملفات تعريفية أساسية للاستجابة الوعائية.
- المخرجات الكمية: تتيح قياس حركية التسرب وتغيرات قطر الأوعية الدموية، مما يوفر قراءات قابلة للتكرار والتوسع لتحسين المقايسة.
- إعادة استخدام المنصة: تدعم جلسات تصوير متكررة على مدار أسابيع، مما يسمح بالفحص الطولي لعوامل التوصيل في ظل ظروف فسيولوجية ثابتة.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- الأهمية المرضية: يحاكي تحديات نفاذية الحاجز الدموي الدماغي (BBB) ذات الصلة بالبشر في الأنظمة قبل السريرية، بما يتوافق مع استراتيجيات المؤشرات الحيوية الانتقالية لدواعي استعمال الجهاز العصبي المركزي (CNS).
- تقليل المخاطر الميكانيكية: يوضح الديناميكيات الزمانية والمكانية لفتح الحاجز، مما يقلل من عدم اليقين في تقييمات الاستجابة للجرعة والسلامة.
- الاستمرارية قبل السريرية: يربط بين مرحلة الاكتشاف والتحقق قبل السريري من خلال تقديم بيانات عالية الدقة وفي الوقت الفعلي عن التغيرات الوعائية أثناء العلاج.
تكامل خطوط المعالجة وسير العمل
تتكامل هذه الطريقة ضمن تسلسل عملية الاكتشاف، بدءاً من التحقق المبكر من الهدف وصولاً إلى تحديد المركبات الرائدة، مما يوفر تغذية راجعة فيزيائية حيوية في الوقت الفعلي حول فعالية آلية التوصيل.
- بيولوجيا الاكتشاف: يدعم اختبار الفرضيات المتعلقة بمعاملات الموجات فوق الصوتية وخصائص الفقاعات الدقيقة وتأثيرها على النفاذية الوعائية في الأنسجة العصبية السليمة.
- الفحص: يوفر أنظمة جاهزة للمقايسة مع وصول وعائي معياري وقراءات فورية للنفاذية لتقييم المركبات.
- التحليلات: يُنتج بيانات كمية عن نضح الديكستران والقياسات المورفومترية الوعائية، مما يسمح بالمقارنة بين الظروف المختلفة ونمذجة الاستجابة للجرعة.
- الأبحاث الانتقالية: يربط بالتحقق قبل السريري من خلال رصد الاستجابات الديناميكية للحاجز الدموي الدماغي (BBB) التنبؤية بتوزيع الدواء في الجسم الحي.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: يؤسس منصة تصوير قابلة لإعادة الاستخدام للتحسين التكراري لبروتوكولات الموجات فوق الصوتية المركزة عبر مشاريع متعددة.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تزيد من الثقة التنبؤية في التحقق من الهدف من خلال تقليل الغموض الميكانيكي في فتح الحاجز الدموي الدماغي (BBB) بوساطة الموجات فوق الصوتية.
- القيمة التشغيلية: تضمن التقييس وقابلية التكرار من خلال تحديد النافذة القحفية، واقتران المحول، ومعايير التصوير.
- القيمة الاستراتيجية: تحسن قرارات المضي قدماً أو التوقف (go/no-go) من خلال تقديم دليل مباشر وفي الوقت الفعلي على كفاءة التوصيل، مما يقلل من المخاطر البيولوجية في المراحل المتأخرة.
- التأثير على المحفظة: تتيح تحديد الأولويات لاستراتيجيات التوصيل بناءً على تعديل المخاطر، وذلك استناداً إلى مقاييس النفاذية الكمية والاستجابة الوعائية.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في جراحة النافذة القحفية للفئران، والمجهر متعدد الفوتونات، وفيزياء الموجات فوق الصوتية.
- يعتمد على أجهزة متخصصة تشمل محولات الطاقة الحلقية، وعدسات شيئية ذات فتحة عددية (NA) عالية، ومجاهر المسح بالليزر النبضي.
- يستلزم توحيد معايير بارامترات السونيكة، وجرعات عامل التباين، ومسارات تحليل الصور بين الفرق البحثية.
- يتضمن اعتبارات التكييف لتناسب سلالات الحيوانات المختلفة، وأحجام النوافذ القحفية، وترددات الموجات فوق الصوتية.
- يتقيد بفترات التعافي الجراحي والالتهابات المحتملة الناتجة عن إجراءات النافذة القحفية المتكررة، كما هو موضح في البروتوكول.
