إعداد الشبكة المجهرية كريو إلكترون للدراسات التي تم حلها عبر الزمن باستخدام نظام روبوتي جديد، Spotiton
فبراير 25, 2021
يصف البروتوكول المعروض هنا استخدام Spotiton ، وهو نظام روبوتي جديد ، لتقديم عينتين من الاهتمام على شبكة نانوية ذاتية الفتل تختلط لمدة لا تقل عن 90 مللي ثانية قبل التزجيج في cryogen السائل.
باستخدام نظام Spotiton الروبوتي ، يمكن للمرء خلط وvitrify بروتين من الفائدة مع شريك التفاعل على شبكة المجهر الإلكتروني في أسرع وقت 90 مللي ثانية. يسمح هذا البروتوكول بالتقاط تأكيدات البروتين الوسيطة العابرة للغاية بحيث لا يمكن التقاطها بواسطة تقنيات إعداد الشبكة القياسية. يمكن أن يقوم Spotiton الذي تم حله بالوقت بإعلام الأنظمة البيولوجية أو الكيميائية الحيوية دون الثانية مثل تنشيط قناة الغشاء أو تخليق الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي أو التفاعل المبكر لعقار أو مضاد مع البروتين المستهدف.
يجب على المستخدم إدارة عدة مكونات تؤثر مباشرة على جودة الشبكة بشكل متزامن. من المهم فهم النظام قبل الاستخدام والصبر عند إعداد الشبكات. للبدء، افتح الصمام الرئيسي على خزان إمدادات النيتروجين وتأكد من ملء خزان النظام بالمياه فائقة البور التي تم إزالة الغازات عنها.
قم بتشغيل الكمبيوتر ونظام Spotiton في قطاع الطاقة متعدد المنافذ. انقر على أيقونة سطح المكتب لفتح واجهة المستخدم لبرنامج Spotiton. في القائمة أدوات، حدد تهيئة مراحل لتهيئة والمنزل الروبوتات محور ثلاثة والتجميع رئيس موزع الدورية، وضمان نصائح موزع تشير إلى أسفل قبل التهيئة ومهتدية.
في القائمة الرئيسية، انقر على الانتقال إلى الوضع الآمن لإرسال الروبوتات إلى الوضع الآمن. في علامة التبويب أسبيرات، حدد رئيس الوزراء لطرد رؤساء موزع عدة مرات مع المياه من الخزان. استمر حتى يمكن رؤية تيارين من المياه دون انقطاع يخرجان من النصائح.
في علامة التبويب فحص، أرسل تلميحا واحدا إلى كاميرا الفحص واختبر مياه الحريق، مع ضبط السعة حتى يتم إنتاج قطرات منفصلة. اضغط على زر تسجيل في شاشة الكاميرا العلوية لتسجيل فيديو من طرف واحد إطلاق النار. أرسل التلميح الثاني إلى كاميرا الفحص.
تشغيل الفيديو من طرف واحد اطلاق النار في الشاشة الجانب الأيمن في نفس الوقت يتم تشغيل تلميح اثنين في شاشة الكاميرا العليا، مطابقة لنمط إنتاج قطرة من موزعين. إزالة الملاقط من جبل على الروبوت الشبكة باستخدام مفتاح ألن الموردة. على سطح مقاعد البدلاء القريبة، ضع جانب نانوواير شبكة اختبار حتى على حافة كتلة الشبكة.
الاستيلاء بعناية على حافة الشبكة ووضعها بشكل صحيح في ملاقط. ثم إعادة تحميل الملاقط. في علامة التبويب Cryo، انقر على تلميح إلى الكاميرا لنقل طرف واحد إلى مجال الرؤية لكاميرا مسار الهبوط العلوي، مع ضمان تحديد Live في شاشة الكاميرا العلوية.
قم بتشغيل ضوء الكاميرا العلوي وضبطه. تلميح موضع واحد مرئي في شاشة الكاميرا العلوية، عن طريق النقر فوق الماوس داخل الشاشة. انقر على الشبكة إلى الكاميرا لوضع الشبكة أمام الكاميرا العلوية، ثم ضبط طرف موقف واحد مرة أخرى إذا لزم الأمر.
في علامة التبويب Cryo، تأكد من عدم تحديد الشبكة Vitrified، انقر فوق هدف قائمة الانتظار، ثم على الهبوط. تقييم الصور العلوية والسفلية للتأكد من موزعات تعمل بشكل طبيعي. تمييع عينتين إلى التركيزات المطلوبة مع عازل مناسب ، من الناحية المثالية باستخدام نفس الشيء لكليهما ، وملء وعاء cryogen بالنيتروجين السائل.
البلازما تنظيف ثلاث إلى أربع شبكات نانوواير باستخدام خمسة واط الهيدروجين والأوكسجين، و 1.5 دقيقة كنقطة انطلاق. سد العجز في البخاخات ومراقبة خروج بخار الميناء المركزي للغطاء البخاخات. مراقبة مراقبة الرطوبة الحية في النافذة الرئيسية أو فتح تعقب الرطوبة المحيطة تحت التقارير والمحيطة.
تحقق من مستويات الرطوبة في مناطق الحجرة والكفن. أضف خمسة ميكرولترات من كل عينة إلى أكواب العينة. قم بتحميل أكواب العينة في صينية الاحتجاز مع عينة للنصيحة الأولى على اليسار وللطرف الثاني على اليمين.
ثم ادفع الدرج مرة أخرى إلى الجهاز حتى يتسع. في علامة التبويب أسبيرات، حدد ثلاثة ميكرولترات لوحدة التخزين التي سيتم يستنشقها كل طرف. تأكد من أن علبة العينة قد تم الجلوس بشكل آمن ، وانقر فوق أسبيرات ، ومراقبة مرحلة ماصة تحريك رؤساء موزع في أكواب العينة.
تحقق من الطموح الناجح لكلا العينتين عن طريق إزالة أكواب العينة ومراقبة انخفاض في مستويات السائل. في علامة التبويب فحص، أرسل كل طرف إلى كاميرا الفحص للتأكد من الاستغناء دون عائق. ضبط السعة حسب الحاجة لمطابقة تشكيل القطيرات من كل طرف.
تحميل البلازما الطازجة تنظيف الشبكة في ملاقط، ولكن لا جبل ملاقط حتى الآن. تأكد من رفع مستوى الرطوبة إلى حوالي 90 إلى 95٪ ملء كأس الإيثان وإجراء اختبار نهائي لاطلاق النار من كل من نصائح أمام الكاميرا التفتيش، مما يؤكد عدم وجود عرقلة. في علامة التبويب كريو، انقر على تلميح إلى الكاميرا.
تحقق من كأس الإيثان. إذا تشكل جليد الإيثان، تذوب حسب الحاجة مع غاز الإيثان إضافية. جبل ملاقط مع الشبكة على مرحلة الشبكة.
في علامة التبويب Cryo، انقر على الشبكة إلى الكاميرا، لضمان وضع طرف واحد بشكل صحيح في شاشة الكاميرا العلوية. انقر على الشبكة Vitrified ، هدف قائمة الانتظار ، ثم يغرق. انقر على موافق عندما يطلب منه الأمر الروبوت الشبكة للقفز الشبكة من الإيثان إلى النيتروجين السائل والإفراج عنه على الرف المغمورة.
فحص صور الشبكة لتحديد ما إذا كان يجب الاحتفاظ بها أو التخلص منها. إذا حفظ الشبكة، قبل بارد ملقط غرامة يميل، فهم بلطف الشبكة من الحافة، ووضعها في فتحة مربع الشبكة، بدءا من الفتحة الأولى على يسار الشق والذهاب في اتجاه عقارب الساعة. استخدم عارض التجارب لمراجعة صور الشبكة ومقارنتها من الكاميرات العلوية والسفلية إلى جانب إعدادات الجهاز وقياسات الرطوبة في وقت الهبوط عن طريق تحديد التقارير والتجربة.
تظهر هنا صور الشبكات التي تم إعدادها خلال جلسة Spotiton واحدة تم حلها زمنيا عن طريق خلط بوليميراز الحمض النووي الريبي في أوليجومر الحمض النووي ثنائي الأساس 105 يحمل تسلسل مروج لمدة 150 مللي ثانية قبل التزجيج. من بين الشبكات الست، يظهر واحد فقط فتل دون المستوى الأمثل. يتطابق نمط ترسب الجليد على شبكة مهززة بشكل وثيق مع نمط السائل المودع الذي يظهر في صورة الكاميرا العلوية.
يحدث فتل فعال للعينات المختلطة على طول قضبان الشبكة المغطاة بأسلاك النانو حيث نادرا ما تفيض العينة إلى مربعات مجاورة لتلك التي هبطت فيها. في المربعات المليئة بالجليد ، يكون الجليد عادة أكثر سمكا داخل الثقوب في وسط الساحة ويصبح أرق في الثقوب الأقرب إلى قضبان الشبكة. غالبا ما تكون الثقوب المجاورة مباشرة لقضبان الشبكة فارغة ، بسبب قربها من الأسلاك النانوية.
الإعداد السليم والتعامل مع شبكات الأسلاك النانوية سيضمن سمك الجليد الجيد على شبكات العينة المختلطة. كما يسمح نظام Spotiton للمستخدم بإيداع العينتين بشكل منفصل على شبكة واحدة ، مما يتيح جمع عنصر تحكم غير مطلق أثناء جلسة صيانة الشبكة نفسها. Spotiton مكنت من التقاط وسيطة الأولى في التعبير الجيني البكتيري في الوقت الحقيقي.
ولأنها تتشكل على مقياس زمني دون ثانية، فإن هياكلها لم تكن معروفة حتى الآن.
نظرة عامة
تقدم هذه الدراسة بروتوكولًا يستخدم نظام Spotiton الروبوتيّ لخلط وتجميد البروتينات بسرعة على شبكة المجهر الإلكتروني. تعمل هذه التقنية على التقاط أشكال البروتين العابرة التي لا تستطيع الطرق القياسية التقاطها، مما يفتح الطريق أمام رؤى حول العمليات البيولوجية الديناميكية.
مكونات الدراسة الرئيسية
منطقة البحث
- تفاعلات البروتين
- الأشكال العابرة
- مجهر إلكتروني بارد
الخلفية
- أهمية دراسة تفاعلات البروتين السريعة
- التحديات في التقاط الحالات العابرة
- فائدة التجميد في البحوث البيولوجية
الطرق المستخدمة
- استخدام نظام Spotiton لخلط العينات وتكويمها
- التطبيق يشمل البروتين والشريك المتفاعل على شبكات سلك نانو
- خلط عالي السرعة لالتقاط الوسائط
النتائج الرئيسية
- تكويم ناجح للعينات المختلطة من البروتين في أقل من 90 مللي ثانية
- امتصاص فعّال على شبكات سلك نانو يضمن سلامة العينة
- تصور واضح لأنماط ترسيب الجليد المترابطة مع نتائج الخلط
الاستنتاجات
- توضح هذه الدراسة بشكل فعّال فائدة Spotiton الموقوت في ملاحظة العمليات البيولوجية السريعة.
- تعزز النتائج فهم ديناميات البروتين وتفاعلاته الحيوية للبحوث البيولوجية.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Capturing transient molecular intermediates is a critical challenge in early-stage drug discovery and structural biology. The Spotiton robotic system enables time-resolved cryo-EM grid preparation, allowing R&D teams to interrogate rapid biomolecular interactions and conformational changes with high temporal precision. This capability enhances predictive confidence in target validation and supports risk-adjusted portfolio decisions at key discovery inflection points.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct observation of short-lived protein conformations relevant to target engagement.
- Supports mechanistic de-risking by capturing intermediate states in protein-ligand or protein-nucleic acid interactions.
- Facilitates functional target validation by revealing structural transitions on sub-second timescales.
Screening & Assay Development
- Prepares validated biological grids for downstream cryo-EM analysis with minimal sample volume.
- Standardizes grid preparation for reproducible, quantitative structural readouts.
- Enables rapid, scalable grid production to support high-throughput screening of molecular interactions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns structural snapshots with disease-relevant mechanisms, informing translational biomarker strategies.
- Provides continuity from discovery-stage mechanistic insights to preclinical model validation.
- Reduces ambiguity in structure-based drug design by capturing elusive intermediate states.
Pipeline & Workflow Integration
The Spotiton system integrates at the interface of early discovery and lead identification, bridging mechanistic interrogation with structural validation workflows.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling capture of rapid molecular events and pathway transitions.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative cryo-EM grids for comparative analysis of compound or biomolecule effects.
- Analytics: Provides high-resolution structural data to inform condition comparisons and mechanistic hypotheses.
- Translational Research: Connects early structural findings to preclinical validation when disease-relevant systems are studied.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, standardized workflow for repeated use across multiple discovery programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable grid preparation for structural studies.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient advancement of discovery assets.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by revealing transient states critical to biological function.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cryo-EM grid handling and robotic system operation.
- Needs access to Spotiton instrumentation and compatible nanowire EM grids.
- Demands rigorous calibration and cross-team standardization for reproducible results.
- Adaptation may be needed for different biomolecular systems or sample types.
- Grid quality is sensitive to humidity control, dispenser calibration, and sample preparation protocols.
