التلقيح الزراعي المباشر لشتلات الذرة عن طريق الحقن مع فيروس فسيفساء ذيل الثعلب المؤتلف وفيروس فسيفساء قصب السكر المستنسخات المعدية

يتم تقديم بروتوكول الحقن القائم على Agrobacterium (الحقن الزراعي) لتلقيح فيروس فسيفساء ذيل الثعلب وفيروسات فسيفساء قصب السكر المستنسخة في شتلات الذرة. يؤدي التلقيح بهذه الطريقة إلى العدوى الفيروسية ، وإسكات الجينات التي يسببها الفيروس للجينات الواسمة ، والإفراط في التعبير الفيروسي عن GFP.

يسمح هذا البروتوكول بتلقيح النواقل الفيروسية مباشرة في مصانع الذرة التي يمكن تطبيقها بسهولة في معظم إعدادات المختبرات دون الحاجة إلى أي معدات متخصصة باهظة الثمن. التلقيح المباشر يلغي استخدام مضيف بديل كمصدر للتلقيح ، مما يوفر الوقت والموارد. ويمكن تطبيق هذه الطريقة على ناقلات فيروسية إضافية، وخطوط الذرة، وربما أنواع أخرى من الأحاديات.

ابدأ بزراعة 1 إلى 2 من بذور الذرة في وسط النمو القائم على الخث في إدراج صغير يوضع داخل الصواني. ضع الصواني في غرفة نمو أقل من 16 ساعة يوميا عند 25 درجة مئوية و 8 ساعات ليلا عند 22 إلى 25 درجة مئوية ، أو في دفيئة عند 22 إلى 25 درجة مئوية مع 16 ساعة يوميا و 8 ساعات ليلا. سقي النباتات بانتظام وتسميدها مرة واحدة في الأسبوع باستخدام 15-5-15 سماد سائل بتركيز 330 جزءا في المليون.

تحضير agrobacterium للحقن عن طريق تلقيح سلالة agrobacterium التي تحتوي على البنية الفيروسية المطلوبة في وسائط LB بالمضادات الحيوية. ثم ، احتضن القارورة أو الأنابيب عند 28 درجة مئوية أثناء الاهتزاز عند 225 دورة في الدقيقة لمدة 24 ساعة. في اليوم التالي ، قم بتكوير البكتيريا عن طريق التركيز عند 4،000 مرة G لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة وتخلص من supernatant.

ثم ، اغسل الكريات بملليلتر واحد من الماء منزوع الأيونات. أعد تعليق الكريات في ملليلتر واحد من محلول كبريتات المغنيسيوم 10 ملليمولار ، وقم بقياس الكثافة البصرية عند 600 نانومتر. ثم اضبطه على 1.0.

استخدم شتلات الذرة التي يتراوح عمرها بين 4 و 7 أيام لحقن البكتيريا الزراعية. تجميع حقنة وإبرة. حقن التعليق البكتيري بلطف 2-3 ملم فوق العقدة القولونية حتى يملأ الكوليوبتيل ، أو يكون مرئيا في الوبر ، معلقا في مرحلة نمو النباتات.

حقن جميع الشتلات وتغيير المحقنة والإبر لحقن كل بناء. تأكيد العدوى المظهرية من خلال مراقبة الآفات من إسكات الجينات الضابطة ، والآفة تحاكي 22 أو ديساتوراز فيتوين على الأوراق. استخدم جهاز تصوير التألق للفحص السريع للنباتات والمجهر الفلوري للكشف عن وجود تعبير GFP.

إجراء تحليل التعبير الجيني للكشف الجزيئي عن العدوى. استخراج الحمض النووي الريبي الكلي من أوراق النباتات المصابة بعد 14 إلى 21 يوما من الإصابة ، وتوليف الحمض النووي الريبي الأول كما هو موضح في مخطوطة النص. قم بإجراء النسخ العكسي PCR لتأكيد العدوى وتحديد سلامة الجين أو جزء الجين ذي الأهمية باستخدام مواد تمهيدية محددة مصممة للتركيبات الفيروسية المختلفة.

تصور منتج PCR على هلام أغاروز 1٪ يحتوي على بقعة حمض نووي لتحديد وجود أو عدم وجود فيروس وجزء من الجين أو الجين. تم استخدام هذا البروتوكول لإدخال الفيروسات المؤتلفة المصممة للجين في شتلات الذرة. بعد حوالي 12 يوما من الحقن ، لوحظ إسكات الأنماط الظاهرية على الأوراق كنخر وتبييض ضوئي.

تم الكشف عن وجود بناء في الأوراق بعد العدوى من خلال مراقبة تعبير البروتين الفلوري الأخضر تحت التألق باستخدام مرشح GFP مختلف. تم تصور تعبير بروتين الفلورسنت الأخضر في الأوراق المصابة بفيروس فسيفساء ذيل الثعلب على أنها مناطق صغيرة مثقوبة من التألق موزعة عبر الأوراق وكبقع كبيرة في الأوراق المصابة بفيروس فسيفساء قصب السكر. باستخدام تحليل التعبير الجيني ، تم تأكيد عدوى فيروس فسيفساء ذيل الثعلب الجهازية ولوحظ إسكات الجينات أو قمع ديساتوراز فيتوين والآفة التي تحاكي 22.

استخدم البناء أيضا كفاءة العدوى المتأثرة. في حالة عدوى فيروس فسيفساء ذيل الثعلب ، فإن فيروس فسيفساء ذيل الثعلب الناقل الفارغ ، وآفة فيروس فسيفساء ذيل الثعلب التي تحاكي 22 عادة ما يكون لديها أعلى كفاءة العدوى بنسبة 53٪ و 54٪ على التوالي. فيروس الفسيفساء ذيل الثعلب phytoene desaturase بكفاءة أقل قليلا عند 39٪ و foxtail فسيفساء فيروس بروتين الفلورسنت الأخضر ، عند أدنى كفاءة عند 16٪ وفي الوقت نفسه ، كانت كفاءة العدوى بفيروس فسيفساء قصب السكر بروتين الفلورسنت الأخضر 8٪ التوقيت وستستند الأعراض إلى الناقل الفيروسي وخط الذرة المستخدم.

قد لا يعني عدم وجود نمط ظاهري مرئي عدم وجود إسكات أو تعبير. يمكن أيضا تطبيق هذه الطريقة على تقنيات تحرير الجينات من خلال تحسين طرق التسليم للحمض النووي الريبي المرشد.