عزل خلايا كبد الفئران الأولية مع التحكم في التروية متعدد المعلمات

يعتمد بروتوكول عزل خلايا كبد الفئران هذا على استئصال الكبد قبل نهج الهضم. يقدم البروتوكول نظام تروية متكامل مدمج ومحمول لعزل الخلايا. تتضمن هذه التقنية إعادة تدوير الكولاجيناز مما يقلل من حجم استخدام الكولاجيناز ، ويوفر المزيد من المرونة في تمديد وقت الهضم مع ضمان إنتاجية عالية من الجاذبية ووظيفة محددة لخلايا الكبد.

ضع الفئران في غطاء محرك السيارة. بعد قطع عضلات البطن ، ادفع الأمعاء إلى اليمين مع الجزء الخلفي من الملقط المنحني. كسر الغشاء تحت القناة الصفراوية مع طرف الملقط المنحني لحلقة خياطة حول الوريد البابي والقناة الصفراوية.

استخدم خياطة جراحية حريرية لصنع رباط فضفاض للغاية حول الوريد البابي بالقرب من الكبد ، قبل فروع الوريد مباشرة إلى اليسار واليمين في فصوص الكبد المختلفة. حوالي سنتيمترين إلى ثلاثة سنتيمترات في المنبع من الرباط الأول ، قبل أن يتفرع الوريد المعدي مباشرة من الوريد البابي ، يخلق ثقبا عبر الأنسجة الموجودة أسفل الوريد البابي بأطراف زوجين من الملقط المنحني. ثم قم بتمديد الثقب لدعم الوريد البابي أثناء التعليب.

منع تراكم الضغط في الكبد عن طريق تقليل سرعة المضخة إلى أربعة دورات في الدقيقة لمعدل تدفق يبلغ حوالي ثلاثة ملليلتر في الدقيقة. وتأكد من تقليل تدفق المخزن المؤقت الخالي من الكالسيوم من القسطرة الوريدية إلى تنقيط بطيء. أثناء دعم الوريد البابي بلطف باستخدام ملقط ، أمسك القسطرة الوريدية مع توجيه شطبة الإبرة لأعلى.

وأدخل الإبرة في الوريد البابي بزاوية 10 إلى 20 درجة. ثم تقدم ببطء حتى يكون الشطب كله داخل الوريد. يجب أن يؤدي الإدخال الصحيح إلى تبييض لون الكبد.

قم بتحريك القنية فوق الإبرة ، وسحب الإبرة خلف القنية عن طريق سحب الجناح إلى الخلف بإصبع السبابة أثناء إمساك القسطرة بالإبهام والإصبع الأوسط. قم بتثبيت الوريد البابي على القسطرة باستخدام مشبك الوريد والمشبك أسفل الوريد البابي لتجنب انقطاع التدفق المندمج. بعد ذلك ، قم بقطع الوريد الأجوف السفلي السفلي لمنع تراكم الضغط في الكبد ، وراقب نبضات الدم الدافعة لضمان القطع الصحيح.

قم بزيادة سرعة المضخة إلى 38 دورة في الدقيقة بمعدل تدفق يبلغ حوالي 33 ملليلتر في الدقيقة. وغسل الكبد ثلاث مرات عن طريق إغلاق الوريد الأجوف السفلي السفلي بالملقط لمدة ثانيتين إلى ثلاث ثوان ، ثم إعادة فتحه. من أجل اختراق جميع فصوص الكبد ، اضبط موضع طرف القنية وتأكد من وضعه قبل فروع الوريد البابي في فصوص الكبد المختلفة.

بعد ذلك ، قم بتشديد الرباط الفضفاض حول الوريد البابي ، قليلا في المنبع من نقطة التفرع ، وتأمين موضع القنية في الوريد البابي لمنع التدفق العكسي للمخزن المؤقت عن طريق عمل ثلاث عقد عند النقطة التي تدعم فيها الإبرة الصلبة القنية ، بين الشطبة والثقب الجانبي. بعد استئصال الكبد ، اسمح للكبد بالتغلغل مع المخزن المؤقت الخالي من الكالسيوم لمدة 12 دقيقة. ثم ، قم بتشديد المشبك الأسطواني للمخزن المؤقت الخالي من الكالسيوم وقم بفك المشبك الأسطواني للمخزن المؤقت للكولاجيناز لتغيير المخزن المؤقت للتروية.

بعد أن يصل الكولاجيناز العازل إلى الكبد ، اغسل الكبد ثلاث مرات عن طريق إغلاق الوريد الأجوف السفلي فوق الكبدي لمدة ثانيتين إلى ثلاث ثوان وإعادة فتحه. حرك الكبد بعناية إلى المرحلة الموجودة أعلى الكأس لإعادة تدوير مخزن الكولاجيناز العازل عن طريق تثبيت الحجاب الحاجز بالملقط مع دعم القسطرة ، مع الحرص على عدم سحب القسطرة لمنع الانفصال العرضي. هضم الكبد لمدة 12 دقيقة ، ووقف التروية عندما يفقد الكبد قوامه البني الناعم ويصبح طريا.

تمديد وقت الهضم إذا لزم الأمر. بعد هضم الكبد قطع الوريد البوابة بعناية إزالة الكانيولا. ثم نقل الكبد إلى DMEM البارد لعزل خلايا الكبد.

اضغط بلطف على الكبد باستخدام الجانب الخلفي من الملقط المنحني لكسر وتقشير كبسولة الغلاتس. وإطلاق خلايا الكبد عن طريق تمايل الكبد بلطف في DMEM حتى يتم فصل الخلايا تماما في الوسائط. كانت صلاحية خلايا الكبد بين 88 إلى 94.8٪ كما هو محدد من خلال الرحلة والعد الأزرق.

كان محصول خلايا الكبد من الفئران التي تزن 200 إلى 300 جرام يصل إلى خمس مرات 10 إلى الخلايا الثامنة لكل عزلة. تظهر الصور التمثيلية تعليق خلايا الكبد غير النقي وتعليق خلايا الكبد المنقي. كانت نقاء خلايا الكبد المعزولة حوالي 96.8٪ والتي تم تحديدها كميا عن طريق حساب الخلايا الملطخة بالفلورسنت الإيجابية للألبومين بالنسبة إلى العدد الإجمالي لنوى الخلية.

في الصور التمثيلية الموضحة بلون زائف ، يمثل اللون الأخضر الألبومين ، ويشير اللون الأزرق إلى نوى الخلية مع الألبومين. يتم تمييز نوى الخلايا بدون ألبومين باللون الأحمر. شكلت خلايا الكبد في مزرعة الساندويتش كاناليكولي الصفراوي المتميز ، وكان لها اتصال جيد بالخلايا الخلوية.

كما هو موضح في اختبارات الألبومين واليوريا والسيتوكروم P450 ، أظهرت خلايا الكبد إفرازا عاليا لليوريا والألبومين. في اليوم الثالث ، أظهرت خلايا الكبد أنشطة إنزيمية عالية ل CYP1A2 و CYP2B1/2 و CYP3B2. كن مستعدا عقليا قبل إدخال الإبرة في الوريد البابي.

عند الإدخال ، سيحتاج الجراح إلى الاستمرار بدون نبض حتى يتم زيادة سرعة المضخة بعد قطع IVC.