إنتاج خلايا CAR-T البشرية التي تم تصميمها من قبل CRISPR
March 15th, 2021
هنا، نقدم بروتوكولا لتحرير الجينات في الخلايا التائية البشرية الأولية باستخدام تقنية CRISPR Cas لتعديل خلايا CAR-T.
بروتوكول المختبر لدينا تمكن من الجمع بين تحرير الجينوم البشري مع العلاج بالخلايا CAR T. الإجراء المختبري هو النهج مع CRISPR-Cas9 في استهداف ما يصل إلى ثلاثة جينات بكفاءة عالية. وأخيرا، نهجنا قادر على أن يترجم إلى تجارب سريرية بشرية.
ويمكن تطبيق الأساليب الموصوفة على البنى الأخرى في جمهورية أفريقيا الوسطى والجينات المستهدفة. وأساس هذه التقنيات قوي بما يكفي لترجمتها إلى نطاق أوسع وإلى المتعاونين الأكاديميين والمتعاونين في الصناعة من أجل مواصلة التطوير. عند محاولة هذا البروتوكول للمرة الأولى، حدد عدد المجموعات في شاشة RNA الدليل لتمكين أوقات الحضانة الدقيقة.
وقد ثبت أن الالتزام بظروف الثقافة وكثافة البذر كما هو موضح أمر بالغ الأهمية في تجربتنا. للبدء، والحصول على خلايا الدم المحيطي أحادية النوى، أو PBMCs، من المتبرعين المتطوعين الأصحاء وعزل CD4 و CD8 الخلايا التائية الإيجابية باستخدام CD4 و CD8 المتاحة تجاريا مجموعات الاختيار. الجمع بين CD4 إيجابية وCD8 الخلايا التائية الإيجابية في نسبة واحدة إلى واحدة واحتضان 3 ملايين خلية لكل ملليلتر في R10, تكملها مع 5 نانوغرام لكل ملليلتر من كل IL7 الإنسان وIL15 الإنسان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
في اليوم التالي، عد الخلايا التائية والطرد المركزي 5 إلى 10 ملايين خلية في 300 مرة G لمدة خمس دقائق. تجاهل جميع supernatant وغسل بيليه الخلية في انخفاض وسائل الإعلام الأساسية المصل الحد الأدنى. إعادة تعليق بيليه في 100 ميكرولتر من محلول المودة النووية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
أثناء غسل الخلايا، قم بإعداد ريبونوكليوبروتين، أو مجمع RNP، عن طريق احتضان 10 ميكروغرام من نواة Cas9 مع 5 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي دليل واحد لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تضمين تحكم وهمية دون RNA دليل واحد. الجمع بين الخلايا إعادة تعليقها مع مجمع RNP وإضافة 4.2 ميكرولتر من أربعة محسن الكهربائي ميكرومولار.
تخلط جيدا ونقلها إلى cuvettes الكهارل. Electroporate الخلايا باستخدام رمز النبض EH111، ثم احتضان 5 ملايين خلية لكل ملليلتر في R10، تكملها 5 نانوغرام لكل ملليلتر IL7 الإنسان وIL15 الإنسان في 30 درجة مئوية لمدة 48 ساعة في 12 لوحات الآبار. بعد الحضانة، تابع تفعيل الخلايا التائية وتوسيعها.
تصميم التمهيديات التسلسل عن طريق إدخال تسلسل amplicon PCR في برنامج تصميم التمهيدي القياسية. سيقترح برنامج التصميم تسلسلات التمهيدي متعددة مناسبة لتسلسل سانجر. اختيار التمهيديات الأمامية وعكس التي تربط مع amplicon ما لا يقل عن 150 أزواج قاعدة المنبع أو المصب من موقع خفض الجيش الملكي النيبالي لضمان جودة تسلسل جيدة حول indels.
استخدم تحليل TIDE للكشف عن كفاءة خروج المغلوب على مستوى الجينوم. تقوم الخوارزمية بدقة بإعادة بناء طيف ال indels من آثار التسلسل وتحسب القيم المربعة R. بعد التنشيط، يتم توسيع الخلايا التائية في الثقافة و cryopreserved للدراسات المستقبلية.
خلال التوسع، يتم تتبع تضاعف عدد السكان وتغيرات الحجم في جميع أنحاء البروتوكول لكل من الخلايا التائية وهمية وتحريرها CAR. ولم تكتشف أي تغييرات هامة في الانتشار والتنشيط أثناء التوسع. مرة واحدة كانت cryopreserved الخلايا، تم تحديد مستويات التعبير CAR لمزيد من الدراسات الوظيفية لكل من الخلايا وهمية تحريرها خروج المغلوب CAR T.
ولم تلاحظ أي تغييرات هامة. يمكن تحديد كفاءة خروج المغلوب باستخدام تقنيات متعددة. في هذه المؤامرات قياس التدفق التمثيلي، تم استهداف PDCD1 وTRAC loci باستخدام الحمض النووي الريبي دليل واحد، مما يدل على كفاءة 90٪ لدليل PDCD1 واحد الجيش الملكي النيبالي و 98٪ لدليل واحد RNA TRAC عبر العديد من المتبرعين الأصحاء.
من المهم التأكد من أن نسب الضرس من Cas9 وتوجيه RNAs دقيقة. أثناء الإجراء ، يجب أن تبقى الخلايا دائما عند أربع درجات مئوية ولا تترك في محلول الكهربوفيروس لفترات طويلة من الزمن. بعد الحفاظ على CAR، يمكن استخدام خلايا CAR T المهندسة CRISPR لإجراء فحوصات وظيفية داخل المختبر وفي الجسم الحي، مثل المقايسات السمية الخلوية وإنتاج السيتوكين ونماذج الماوس السرطانية المتجانسة أو الزينوغرافية.
نهجنا باستخدام تكنولوجيا CRISPR Cas9 يتم تطبيقه الآن على التجارب السريرية. ويمكن استخدام هذا النهج لكل من السرطان، فضلا عن الاضطرابات الوراثية غير الخبيثة، مثل الهيموغلوبينوفاتات، التي تؤثر على الملايين من الأطفال والبالغين في جميع أنحاء العالم.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة بروتوكولاً لتحرير الجينات في الخلايا التائية البشرية الأولية باستخدام تقنية CRISPR-Cas لتعديل الخلايا CAR-T. تسمح المنهجية باستهداف عدة جينات بشكل فعّال، مما يمهد الطريق للتطبيقات السريرية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- تحرير الجينات
- العلاج المناعي
- تقنية CRISPR
الخلفية
- تحرير الجينوم البشري هو مجال يتقدم بسرعة.
- العلاج بالخلايا التائية CAR-T أظهر وعدًا في علاج أنواع مختلفة من السرطان.
- CRISPR-Cas9 هو أداة قوية للتعديلات الوراثية الدقيقة.
- يمكن أن يؤدي الجمع بين هذه التقنيات إلى تحسين النتائج العلاجية.
غرض الدراسة
- تطوير بروتوكول قوي لتحرير الجينات في الخلايا التائية.
- لتمكين تعديل الخلايا التائية CAR-T لتحسين الفعالية.
- تسهيل ترجمة هذه الطرق إلى التجارب السريرية.
الطرق المستخدمة
- تقنية CRISPR-Cas9 لاستهداف الجينات.
- فحص RNA التوجيهي لتحسين تحرير الجينات.
- بروتوكولات حضانة مصممة لتعديل الخلايا التائية.
- تطبيق الطرق على مختلف هياكل CAR.
النتائج الرئيسية
- كفاءة عالية في استهداف ما يصل إلى ثلاثة جينات في وقت واحد.
- الطرق قابلة للتكيف مع هياكل CAR المختلفة.
- إمكانية القابلية للتطوير في الأوساط الأكاديمية والصناعية.
- تدعم النتائج الأولية الناجحة جاهزية التجربة السريرية.
الاستنتاجات
- يوفر البروتوكول أساسًا للعلاجات المتقدمة بالخلايا التائية CAR-T.
- يمكن تطبيق التقنيات القوية في سياقات بحثية مختلفة.
- ستركز الدراسات المستقبلية على تحسين هذه الطرق والتحقق منها.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
CRISPR-engineered CAR-T cell production enables multiplex gene editing for next-generation adoptive cell therapies, directly addressing biological de-risking and target validation challenges in immuno-oncology pipelines. This protocol supports robust, scalable workflows for functional interrogation of gene targets and CAR constructs, facilitating predictive confidence at key discovery and translational inflection points. Its universal applicability positions it as a reusable platform for both hematological and solid tumor R&D portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional knockout of candidate genes to clarify mechanistic roles in T cell biology.
- Supports multiplexed hypothesis testing for pathway de-risking and target prioritization.
- Facilitates rapid lead gRNA selection and validation for translational continuity.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, reproducible CAR-T cell populations for downstream functional assays.
- Provides quantitative knockout efficiency metrics via TIDE analysis and flow cytometry.
- Prepares engineered cells for high-throughput cytotoxicity and cytokine screening platforms.
Translational & Preclinical Research
- Aligns engineered CAR-T cells with in vitro and in vivo disease-relevant models for efficacy testing.
- Enables continuity from gene editing through preclinical validation and functional assessment.
- Supports risk-adjusted advancement decisions for clinical translation of novel CAR-T constructs.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates from early discovery through lead identification and preclinical validation, supporting iterative target interrogation and functional screening.
- Discovery Biology: Provides a platform for null hypothesis testing and mechanistic de-risking of gene targets in T cells.
- Screening: Standardizes CAR-T cell preparation for reproducible, quantitative assay outputs.
- Analytics: Enables precise measurement of knockout efficiency and CAR expression for comparative analyses.
- Translational Research: Bridges engineered cell production with in vivo efficacy and biomarker studies.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, adaptable workflow for diverse CAR constructs and gene targets across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in CAR-T development.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable gene editing workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by enabling robust target validation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of CAR-T assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in T cell isolation, CRISPR-Cas9 editing, and flow cytometry analytics.
- Demands access to electroporation instrumentation and validated analytical platforms.
- Necessitates strict adherence to culture conditions and reagent ratios for reproducibility.
- Adaptable to various CAR constructs and gene targets with appropriate gRNA design.
- Practical limitations include cell viability and editing efficiency variability across donors.
