إنتاج خلايا CAR-T البشرية التي تم تصميمها من قبل CRISPR

بروتوكول المختبر لدينا تمكن من الجمع بين تحرير الجينوم البشري مع العلاج بالخلايا CAR T. الإجراء المختبري هو النهج مع CRISPR-Cas9 في استهداف ما يصل إلى ثلاثة جينات بكفاءة عالية. وأخيرا، نهجنا قادر على أن يترجم إلى تجارب سريرية بشرية.

ويمكن تطبيق الأساليب الموصوفة على البنى الأخرى في جمهورية أفريقيا الوسطى والجينات المستهدفة. وأساس هذه التقنيات قوي بما يكفي لترجمتها إلى نطاق أوسع وإلى المتعاونين الأكاديميين والمتعاونين في الصناعة من أجل مواصلة التطوير. عند محاولة هذا البروتوكول للمرة الأولى، حدد عدد المجموعات في شاشة RNA الدليل لتمكين أوقات الحضانة الدقيقة.

وقد ثبت أن الالتزام بظروف الثقافة وكثافة البذر كما هو موضح أمر بالغ الأهمية في تجربتنا. للبدء، والحصول على خلايا الدم المحيطي أحادية النوى، أو PBMCs، من المتبرعين المتطوعين الأصحاء وعزل CD4 و CD8 الخلايا التائية الإيجابية باستخدام CD4 و CD8 المتاحة تجاريا مجموعات الاختيار. الجمع بين CD4 إيجابية وCD8 الخلايا التائية الإيجابية في نسبة واحدة إلى واحدة واحتضان 3 ملايين خلية لكل ملليلتر في R10, تكملها مع 5 نانوغرام لكل ملليلتر من كل IL7 الإنسان وIL15 الإنسان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.

في اليوم التالي، عد الخلايا التائية والطرد المركزي 5 إلى 10 ملايين خلية في 300 مرة G لمدة خمس دقائق. تجاهل جميع supernatant وغسل بيليه الخلية في انخفاض وسائل الإعلام الأساسية المصل الحد الأدنى. إعادة تعليق بيليه في 100 ميكرولتر من محلول المودة النووية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.

أثناء غسل الخلايا، قم بإعداد ريبونوكليوبروتين، أو مجمع RNP، عن طريق احتضان 10 ميكروغرام من نواة Cas9 مع 5 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي دليل واحد لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تضمين تحكم وهمية دون RNA دليل واحد. الجمع بين الخلايا إعادة تعليقها مع مجمع RNP وإضافة 4.2 ميكرولتر من أربعة محسن الكهربائي ميكرومولار.

تخلط جيدا ونقلها إلى cuvettes الكهارل. Electroporate الخلايا باستخدام رمز النبض EH111، ثم احتضان 5 ملايين خلية لكل ملليلتر في R10، تكملها 5 نانوغرام لكل ملليلتر IL7 الإنسان وIL15 الإنسان في 30 درجة مئوية لمدة 48 ساعة في 12 لوحات الآبار. بعد الحضانة، تابع تفعيل الخلايا التائية وتوسيعها.

تصميم التمهيديات التسلسل عن طريق إدخال تسلسل amplicon PCR في برنامج تصميم التمهيدي القياسية. سيقترح برنامج التصميم تسلسلات التمهيدي متعددة مناسبة لتسلسل سانجر. اختيار التمهيديات الأمامية وعكس التي تربط مع amplicon ما لا يقل عن 150 أزواج قاعدة المنبع أو المصب من موقع خفض الجيش الملكي النيبالي لضمان جودة تسلسل جيدة حول indels.

استخدم تحليل TIDE للكشف عن كفاءة خروج المغلوب على مستوى الجينوم. تقوم الخوارزمية بدقة بإعادة بناء طيف ال indels من آثار التسلسل وتحسب القيم المربعة R. بعد التنشيط، يتم توسيع الخلايا التائية في الثقافة و cryopreserved للدراسات المستقبلية.

خلال التوسع، يتم تتبع تضاعف عدد السكان وتغيرات الحجم في جميع أنحاء البروتوكول لكل من الخلايا التائية وهمية وتحريرها CAR. ولم تكتشف أي تغييرات هامة في الانتشار والتنشيط أثناء التوسع. مرة واحدة كانت cryopreserved الخلايا، تم تحديد مستويات التعبير CAR لمزيد من الدراسات الوظيفية لكل من الخلايا وهمية تحريرها خروج المغلوب CAR T.

ولم تلاحظ أي تغييرات هامة. يمكن تحديد كفاءة خروج المغلوب باستخدام تقنيات متعددة. في هذه المؤامرات قياس التدفق التمثيلي، تم استهداف PDCD1 وTRAC loci باستخدام الحمض النووي الريبي دليل واحد، مما يدل على كفاءة 90٪ لدليل PDCD1 واحد الجيش الملكي النيبالي و 98٪ لدليل واحد RNA TRAC عبر العديد من المتبرعين الأصحاء.

من المهم التأكد من أن نسب الضرس من Cas9 وتوجيه RNAs دقيقة. أثناء الإجراء ، يجب أن تبقى الخلايا دائما عند أربع درجات مئوية ولا تترك في محلول الكهربوفيروس لفترات طويلة من الزمن. بعد الحفاظ على CAR، يمكن استخدام خلايا CAR T المهندسة CRISPR لإجراء فحوصات وظيفية داخل المختبر وفي الجسم الحي، مثل المقايسات السمية الخلوية وإنتاج السيتوكين ونماذج الماوس السرطانية المتجانسة أو الزينوغرافية.

نهجنا باستخدام تكنولوجيا CRISPR Cas9 يتم تطبيقه الآن على التجارب السريرية. ويمكن استخدام هذا النهج لكل من السرطان، فضلا عن الاضطرابات الوراثية غير الخبيثة، مثل الهيموغلوبينوفاتات، التي تؤثر على الملايين من الأطفال والبالغين في جميع أنحاء العالم.