أساليب الثقافة لدراسة التفاعلات Apical محددة باستخدام نماذج الجهاز المعوي
March 23rd, 2021
هنا نقدم اثنين من البروتوكولات التي تسمح النمذجة من التفاعلات المعوية apical محددة. تسهل الطبقات الأحادية المعوية المشتقة من الجهاز وثقافات واجهة الهواء السائل (ALI) توليد الظهارة المتباينة بشكل جيد والتي يمكن الوصول إليها من كلا الجانبين الإنارة والباسولاتيري ، في حين أن الأجهزة المعوية المقلوبة القطبية تعرض جانبها العضي وقابلة للمقاسات عالية الإنتاجية.
تهدف هذه الدراسات إلى توفير أنظمة نموذج قوية وقابلة للاستنساخ لإجراء دراسات توجيهية محددة للظهارة المعوية. يمكن أن تولد الأجهزة العضوية Apical بأعداد كبيرة وعقد الوعد لفحص الإنتاجية العالية. من الأسهل التلاعب بالطواهر الأحادية وتوفر الوصول إلى كل من الإشارات القاعدية والبازلية.
تأكد من أن حجم organoids هو 150 إلى 250 ميكرومتر في القطر قبل بدء بروتوكول الانعكاس. إزالة بعناية والتخلص من المتوسطة من كل بئر تحتوي على organoids دون تعطيل قبة ECM. إضافة ملليلتر واحد من الجليد الباردة حل الانفصال إلى كل بئر واحتضان لوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة.
إزاحة القباب بعناية عن طريق الأنابيب ببطء مع طرف المغلفة، مع الحرص على عدم تعطيل وتفتيت organoids. نقل تعليق organoid إلى لوحة تعامل مع حل مكافحة الالتزام ووضع لوحة على شاكر في أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد 30 دقيقة إزالة لوحة وماصة بلطف الحل صعودا وهبوطا باستخدام طرف ماصة ملليلتر واحد المغلفة مع حل مكافحة الالتزام.
ضع الطبق على شاكر في أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة أخرى. إزالة لوحة والسماح لل organoids تسوية بالجاذبية لمدة دقيقة إلى دقيقتين في درجة حرارة الغرفة. بعد تسوية organoids، وإزالة أكبر قدر ممكن من محلول الانفصال وغسلها عن طريق إضافة 1.5 ملليلتر من DMEM F-12.
السماح لل organoids إلى الرواسب وإزالة supernatant. ثم كرر الغسيل. إزالة أكبر قدر من DMEM F-12 ممكن وإضافة 0.5 ملليلتر من الأمعاء الجهازية توسيع المتوسطة.
احتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. في اليوم التالي إجراء تغيير متوسط جزئي عن طريق إمالة لوحة في زاوية 25 إلى 30 درجة وإزالة المتوسطة على طول جدار البئر مع الحرص على عدم إزالة organoids المعلقة. إضافة 0.4 ملليلتر من الأمعاء الجهازية توسيع المتوسطة واحتضان في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ثلاثة أيام.
إذا شكلت المجاميع استخدام طرف ماصة ملليلتر واحد المغلفة مع حل مكافحة أتباع لقص المجاميع عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا 20 مرة أثناء الضغط على نهاية الطرف إلى أسفل لوحة. إضافة ملليلتر واحد من 0.05٪ تريبسين-EDTA قبل الحارة إلى organoids resuspend. وتخلط جيدا لضمان تعليق حتى.
إضافة ما يصل إلى ملليلتر واحد إضافية من تريبسين-EDTA لعدد كبير من الخلايا، أو إذا كان لا يزال كمية كبيرة من ECM. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة خمس إلى 10 دقائق، ثم تخلط جيدا مع ماصة ملليلتر واحد لتعطيل organoids بحيث انهم فصل تماما في خلايا واحدة أو شظايا صغيرة. نأي الشظايا تماما أو الأجهزة العضوية الكاملة مواصلة الحضانة مع تريبسين-EDTA في 37 درجة مئوية لمدة ثلاث إلى خمس دقائق أخرى.
مرة واحدة يتم فصل الأجهزة بما فيه الكفاية إضافة حجم متساو من DMEM F-12 وماصة صعودا وهبوطا لخلط جيدا. تعطيل تريبسين-EDTA بإضافة 10٪ FBS إلى الخلايا. شظايا الطرد المركزي في 200 مرة G لمدة خمس دقائق في درجتين إلى ثماني درجات مئوية.
إذا فشلت الأجهزة العضوية المفككة في خلط الخلايا بدقة عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا والطرد المركزي لهم مرة أخرى. إزالة بعناية أكبر قدر ممكن من supernatant. ترك فقط بيليه الخلية.
Resuspend الخلايا في 100 ميكرولتر من التمايز الجهازي المعوي المتوسطة لكل بئر لتكون البذور. ضبط مستوى الصوت بشكل مناسب لأحجام الآبار الكبيرة أو الأصغر. إزالة لوحات المغلفة من الحاضنة وإزالة محلول مصفوفة غشاء الطابق السفلي الزائدة من كل بئر.
إضافة 100 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى البئر العلوي من كل إدراج ثقافة الخلية و 500 ميكرولتر من التمايز الجهازي المعوي المتوسطة إلى أسفل البئر. ثم تحتضن في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. استبدل الوسط في كل من الآبار العليا والسفلى كل يومين إلى ثلاثة أيام.
لإنشاء ثقافة ALI إزالة المتوسطة من الآبار العليا والسفلى، وإضافة التمايز العضوي المعوي الطازجة المتوسطة إلى البئر السفلي ترك البئر العلوي فارغة. أظهرت الأجهزة العضوية المعوية المستزرعة مع متوسط التوسع العضوي المعوي مورفولوجيا كيسية. عندما تتم إزالة ECM بعض organoids تميل إلى تجميع خلال الأيام الثلاثة الأولى وتحتاج إلى أن تكون محض في زيادة عدد organoid.
واصلت الأجهزة العضوية المعوية المستزرعة في ECM التوسع وإظهار التكوين التلقائي للهياكل الناشئة الثانوية. الأجهزة العضوية التي تم الحفاظ عليها لمدة خمسة أيام في غياب مصفوفة خارج الخلية أظهرت أشكال ممدودة وكيسية وغير منتظمة. تم الكشف عن التعبير عن علامات غير نمطية، مثل فيرلين وZO-1 الجانب الخارجي من الظهارة التي تعرضت للوسط.
ECM جزءا لا يتجزأ من organoids ملطخة النوى، فيلين، وZO-1 مما يدل على قطبية القاعدية apical حيث كان الجانب apical تواجه التجويف من organoid. مرة واحدة تم تأسيس monolayer الخلايا شكلت تقاطعات ضيقة وطبقة التقاء. طبقة التقاء توجه أيضا فيلين التي تحتوي على الحدود فرشاة نحو الجانب apical من الظهارة، وتشكيل مجمعات البروتين متعددة ZO-1 بين الخلايا.
أدى الانتقال إلى ثقافة ALI إلى مزيد من التمايز مع خلايا الكؤوس الأكثر بروزا التي تم تصورها عن طريق تلطيخ بروتين الموسين المفرز MUC2 للحث على انقلاب القطبية ، فمن الأهمية بمكان إزالة جميع ECM دون تعطيل أو تجزئة الأعضاء العضوية. وينبغي أيضا أن يتم إجراء تغييرات وسائل الإعلام بعناية وذلك لتجنب إزالة أي من organoids المعلقة. ضمان وجود خلايا واحدة كافية لإنشاء ثقافة أحادية الطبقة هو محدد رئيسي لجودتها.
وظائف apical محددة مثل امتصاص المواد الغذائية أو التفاعلات مسببات الأمراض المضيفة يمكن الآن درس في النظم ذات الصلة التي تناسب احتياجات الباحثين.
النظرة العامة
تقدم هذه الدراسة بروتوكولات لنمذجة التفاعلات المعوية المحددة للقمة باستخدام الأحاديات المشتقة من العضويات وثقافات واجهة الهواء-السائل (ALI). تولد هذه النماذج ظهارة متمايزة بشكل جيد والتي يمكن الوصول إليها من الجانبين اللميني والقاعدي الجانبي، مما يوفر منصات واعدة للفحص عالي الإنتاجية والدراسات المحددة للتوجيه الظهاري المعوي.
مكونات الدراسة الرئيسية
منطقة البحث
- نمذجة الظهارة المعوية
- الفحص عالي الإنتاجية
- تقنيات زراعة الخلايا
الخلفية
- أهمية دراسة الاستقطاب المعوي
- الحاجة إلى أنظمة نموذجية قوية
- التطبيقات في دراسات امتصاص المغذيات وتفاعلات المسببات المرضية
الطرق المستخدمة
- إنشاء أحاديات معوية وثقافات ALI
- أنظمة مشتقة من العضويات
- الاختبارات عالية الإنتاجية وبروتوكولات التفكك
النتائج الرئيسية
- تأسيس العضويات المحددة للقمة والأحاديات بنجاح
- ملاحظة التمايز والاستقطاب في الثقافات
- تبين التعبير السليم للعلامات الظهارية
الخلاصات
- توفر الدراسة طرقًا فعالة لنمذجة التفاعلات الظهارية المعوية
- تعزز فهم الاستقطاب وآثاره على البحث البيولوجي
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Access to the apical surface of intestinal organoids is a critical bottleneck for modeling nutrient absorption and host-microbe interactions in drug discovery. The described polarity inversion and monolayer culture methods enable orientation-specific studies, supporting predictive confidence in early target validation and mechanistic de-risking. These platforms enhance translational continuity and scalability for high-throughput screening and precision medicine initiatives.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Facilitates interrogation of apical-specific pathways relevant to gut biology and disease.
- Enables mechanistic de-risking by modeling nutrient uptake and host-pathogen interactions in a controlled system.
- Supports functional target validation by allowing direct manipulation and observation of the apical epithelium.
Screening & Assay Development
- Provides reproducible, scalable systems for high-throughput compound screening targeting apical functions.
- Enables quantitative readouts of epithelial barrier integrity and transporter activity.
- Standardizes assay conditions for cross-study and cross-team reproducibility.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro models with disease-relevant epithelial polarity and cell-type composition.
- Supports biomarker discovery and validation by enabling access to both apical and basal compartments.
- Improves predictive value for preclinical assessment of drug absorption and host response.
Pipeline & Workflow Integration
These culture methods position organoid models as a bridge from early discovery through lead identification and preclinical validation, supporting both mechanistic studies and scalable screening.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of apical-specific mechanisms and pathway modulation.
- Screening: Delivers assay-ready, orientation-specific systems for compound evaluation.
- Analytics: Provides quantitative outputs such as tight junction integrity and marker localization.
- Translational Research: Maintains disease-relevant polarity and differentiation for biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, reusable platform for diverse R&D applications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in gut epithelium studies.
- Operational Value: Enhances reproducibility, scalability, and standardization across teams.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust early-stage data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of gut-targeted programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in organoid culture and polarity manipulation.
- Demands access to specialized cell culture and imaging infrastructure.
- Necessitates rigorous cross-team standardization for reproducibility.
- Adaptation may be needed for different organoid sources or disease models.
- Careful handling is essential to avoid organoid disruption during ECM removal and monolayer establishment.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:32
Inversion of Intestinal Organoid Polarity
2:57
Dissociating Intestinal Organoids for Monolayer Generation and Culture
5:21
Results I: Analysis and Characterisation of the Morphology and Cell Polarity of Intestinal Organoids
6:27
Results II: Analysis and Characterisation of the Morphology and Differentiation Markers of Intestinal Monolayers
7:03
Conclusion
