استراتيجيات لتحسين الحصول على بيانات التصوير المقطعي الإلكتروني المبرد
March 19th, 2021
يتطلب الطلب المتزايد على جمع البيانات على نطاق واسع في التصوير المقطعي الإلكتروني المبرد إجراءات اكتساب الصور عالية الإنتاجية. ويرد هنا بروتوكول ينفذ التطورات الأخيرة لاستراتيجيات الاستحواذ المتقدمة التي تهدف إلى تعظيم كفاءة الوقت والإنتاجية لجمع البيانات الطبوغرافية.
إعداد جلسة عمل جمع البيانات على نطاق واسع هو إجراء تستغرق وقتا طويلا التي يمكن أن تقلل إلى حد كبير من الوقت المجهر المتبقية المتاحة لاكتساب سلسلة الميل. تمكن هذه الطريقة من الإعداد السريع لاكتساب بيانات التصوير المقطعي الآلي على نطاق واسع لتحقيق أقصى قدر من الكفاءة الزمنية لتجارب التصوير المقطعي التي تتطلب اختيارا دقيقا لأهداف الاستحواذ. ابدأ بفتح مثيل SerialEM وهمية.
بمجرد تعيين مربع الشبكة الأول استخدم دمج الخيار قائمة المستكشف SerialEM لمشاهدة المونتاج في مثيل SerialEM وهمية. انقر نقرا مزدوجا فوق نافذة المتصفح لفتح خريطة مربع الشبكة. البحث في الخريطة واستخدام الخيار الوهمية SerialEM الملاح إضافة نقاط لإضافة نقاط الحصول على صورة على الهدف من الاهتمام.
بعد تعيين المربعات الجديدة، حفظ ملف المستكشف ودمج الملاح مرة أخرى. استمر حتى يتم تعيين كافة مربعات الشبكة. مرة أخرى، دمج ملف المستكشف مع مثيل SerialEM وهمية.
تشغيل البرنامج النصي مخططات الظاهرية Pi EM من القائمة SerialEM وهمية. حدد الأدوات وحدد خرائط الارتساء الظاهرية. قد يستغرق ذلك بعض الوقت اعتمادا على حجم وكمية خرائط مربع الشبكة، بالإضافة إلى إعادة صياغة خرائط العرض والمعاينة.
لضمان أداء المجهر المناسب، استخدم نفس إعداد حجم التكبير والحزمة للحصول على البيانات بالترتيب التالي. تشغيل محاذاة SerialEM خالية من غيبوبة بواسطة CTF. إدراج ووسط فتحة الهدف.
تشغيل الاستجماتيزم الصحيح SerialEM بواسطة CTF و GIF لحن سريع. في SerialEM فتح ملف المستكشف الجديد. إلغاء تحديد كافة النقاط A.
حدد خرائط العرض الأولى. حدد طي. انقر على انهيار مرتين وإزالة التحديد.
حدد موضع خريطة العرض الأول. اضغط Shift T، ثم حدد موضع خريطة العرض الأخير واضغط على Shift T مرة أخرى. اختر صور إطار مفرد في خصائص الملف لفتح مربع حوار.
في مربع الحوار خصائص الملف التالي، حدد المعلمات المطلوبة وفقا لاحتياجات التصوير وإعداد الأداة. عند المطالبة، قم بإعطاء اسم برقم وانقر على الحفظ. قم بإعداد وحدة تحكم سلسلة الميل لأول موضع TS.
عند الانتهاء، انقر فوق موافق لتعيين هذه المعلمات لكافة سلسلة الميل بعد عنصر الامتلاك هذا. يتم الآن تحديد كافة مخططات المعاينة ك TS مع اسم ملف مرقم. إذا لزم الأمر، قم بتعيين مسافة التركيز/المسار لكل هدف.
انقر نقرا مزدوجا فوق خريطة العرض لتحميله. حدد خريطة المعاينة في قائمة الملاح. ثم حدد تحرير التركيز في إطار الملاح.
في لوحة التحكم ذات الجرعة المنخفضة، قم بتدوير محور الدوران بين المناطق لوضع التجربة والتركيز على طول محور إمالة المرحلة. انقر فوق المنطقة المطلوبة في خريطة العرض المحملة لتعيين موضع تجربة التركيز لسلسلة الميل هذه والتأكد من أن عنصر الملاح لديه مجموعة TSP. كرر الإجراء لكافة العناصر.
تحرير نطاق التركيز في PreTomo البرنامج النصي الذي يعمل قبل كل سلسلة الميل. في القائمة سلسلة الميل SerialEM تحقق تشغيل البرنامج النصي في TS وحدد رقم البرنامج النصي للبرنامج النصي أثناء كل إمالة. تحقق من مستوى خزان النيتروجين وما إذا كان يتم تحديد توربو محمل السيارات قبالة.
تحقق من المساحة الحرة لتخزين البيانات. في القائمة ملف SerialEM إلغاء تحديد الحفظ المستمر لملف السجل. ستحصل كل سلسلة إمالة على ملف السجل الخاص بها.
بعد النقر على الحصول على العناصر في قائمة التنقل، تشغيل PreTomo السيناريو. حدد المهمة الأساسية الحصول على سلسلة الميل، ثم حدد تشغيل البرنامج النصي بعد PostTomo. حدد صمامات العمود إغلاق في نهاية وإرسال البريد الإلكتروني في نهاية، ثم انقر على الذهاب.
تم اختيار 71 مربعا مناسبا على خريطة الشبكة عند التكبير السفلي. تم الحصول على خرائط التكبير المتوسطة مع الإعدادات التي تسمح للتصور المباشر وتحديد عينة من الاهتمام، والفيروسات التاجية في هذه الحالة. وكان وقت الاستحواذ ثلاث دقائق لكل مربع، وثلاث ساعات و45 دقيقة في المجموع.
كما تم إنشاء الخريطة المربعة الأولى، تم فتح مثيل SerialEM وهمية على جهاز كمبيوتر منفصل لتصور الخريطة المربعة وإضافة نقاط على أهداف مناسبة لاكتساب سلسلة الميل. تم إعداد جرعة منخفضة SerialEM وتم التقاط عرض المرجع وصور المعاينة وحفظها كخرائط. يمكن استخدام الخرائط الأخيرة مباشرة على مثيل SerialEM الوهمي لإنشاء طريقة العرض الظاهرية والمعاينة الظاهرية من صور الخريطة المربعة المقابلة.
تم استخدام خرائط العرض الظاهرية للتوسيط الأولي للهدف، متبوعة بتوسيط نهائي تم إجراؤه في تكبير اكتساب سلسلة الميل الفعلي باستخدام خريطة المعاينة الافتراضية. يجب على المستخدمين السماح لأنفسهم متسع من الوقت لاستكشاف المناظر الطبيعية عينة. بعد البحث في بعض الخرائط ، يطور المرء شعورا أفضل بالمناطق ذات الجودة الجيدة لجمع البيانات منها.
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة بروتوكولًا مصممًا لتعزيز كفاءة التصوير المقطعي الإلكتروني بالتبريد، بهدف تلبية الحاجة لجمع البيانات على نطاق واسع. تركز الطريقة على تحسين إعداد التصوير لضمان الإنتاجية العالية أثناء الحصول على سلسلة الميل، مما يؤدي إلى تحسين كبير في استخدام المجهر.
مكونات الدراسة الرئيسية
منطقة البحث
- التصوير المقطعي الإلكتروني بالتبريد
- اكتساب الصور عالي الإنتاجية
- تقنيات التصوير المجهري
الخلفية
- الطلب المتزايد على جمع البيانات على نطاق واسع
- الإعدادات التي تستهلك الكثير من الوقت يمكن أن تحد من وقت استخدام المجهر الفعال
- أهمية طرق جمع البيانات المقطعية الفعالة
الطرق المستخدمة
- بروتوكول لاكتساب بيانات التصوير المقطعي الآلي
- استخدام SerialEM لتحديد موقع خرائط مربع الشبكة
- تنفيذ الخرائط الافتراضية لتحديد وسط الهدف
النتائج الرئيسية
- تم تحديد 71 مربعًا للشبكة للحصول على البيانات
- جمع البيانات بكفاءة مع وقت إجمالي لاكتساب قدره 3 ساعات و 45 دقيقة
- القدرة المثبتة على تصور عينات الفيروس التاجي بشكل فعال
الاستنتاجات
- توضح هذه الدراسة نهجًا مبسطًا للتصوير عالي الإنتاجية في التصوير المقطعي
- تؤكد النتائج على أهمية تعظيم كفاءة الاكتساب في البحث البيولوجي
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Efficient cryogenic electron tomography (cryoET) data acquisition is critical for high-resolution structural biology, enabling rapid and reproducible 3D analysis of macromolecular complexes. Automated workflows using SerialEM and PyEM streamline grid mapping and target selection, maximizing microscope utilization and reducing operational bottlenecks. These advances directly impact early discovery and structural validation pipelines in biopharma R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Accelerates structural interrogation of biological assemblies in near-native states.
- Supports functional target validation by enabling high-throughput acquisition of tilt series.
- Improves predictive confidence in macromolecular complex analysis for portfolio triage.
Screening & Assay Development
- Enables preparation of validated 3D structural datasets for downstream screening workflows.
- Standardizes acquisition routines, enhancing reproducibility and quantitative output quality.
- Facilitates scalable, automated data collection for reliable compound evaluation platforms.
Translational & Preclinical Research
- Aligns structural data acquisition with disease-relevant systems, such as viral particles.
- Ensures continuity from discovery-stage imaging to preclinical structural validation.
- Reduces risk in translational research by supporting robust, high-throughput data generation.
Pipeline & Workflow Integration
This automated cryoET workflow integrates from early discovery through lead identification and preclinical research, supporting structural hypothesis testing and target de-risking.
- Discovery Biology: Enables rapid hypothesis testing and pathway clarification via high-resolution 3D imaging.
- Screening: Provides reproducible, quantitative tilt series datasets for assay readiness.
- Analytics: Delivers standardized measurements and readouts for comparative structural analysis.
- Translational Research: Supports biomarker alignment and preclinical continuity when imaging disease-relevant complexes.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, reusable platform for automated tomography data acquisition across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in structural studies.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and throughput of data acquisition sessions.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and capital efficiency by maximizing instrument time.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of structurally validated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cryoEM instrumentation and data analysis software.
- Depends on access to high-end transmission electron microscopes and computational infrastructure.
- Demands cross-team standardization of acquisition parameters and data management practices.
- May require adaptation for different sample types or grid formats.
- Operational limitations include manual input for initial target selection and quality assessment.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:38
Selecting the Targets
1:31
Generate Virtual Maps
2:07
Microscope Tuning
2:43
Set up Navigator
4:05
Set the Focus/Track Positions
5:00
Set up Additional Scripts
5:27
Run
6:19
Results: Optimization of Cryogenic Electron Tomography Data Acquisition
7:46
Conclusion
