مارس 19, 2021
يتطلب الطلب المتزايد على جمع البيانات على نطاق واسع في التصوير المقطعي الإلكتروني المبرد إجراءات اكتساب الصور عالية الإنتاجية. ويرد هنا بروتوكول ينفذ التطورات الأخيرة لاستراتيجيات الاستحواذ المتقدمة التي تهدف إلى تعظيم كفاءة الوقت والإنتاجية لجمع البيانات الطبوغرافية.
إعداد جلسة عمل جمع البيانات على نطاق واسع هو إجراء تستغرق وقتا طويلا التي يمكن أن تقلل إلى حد كبير من الوقت المجهر المتبقية المتاحة لاكتساب سلسلة الميل. تمكن هذه الطريقة من الإعداد السريع لاكتساب بيانات التصوير المقطعي الآلي على نطاق واسع لتحقيق أقصى قدر من الكفاءة الزمنية لتجارب التصوير المقطعي التي تتطلب اختيارا دقيقا لأهداف الاستحواذ. ابدأ بفتح مثيل SerialEM وهمية.
بمجرد تعيين مربع الشبكة الأول استخدم دمج الخيار قائمة المستكشف SerialEM لمشاهدة المونتاج في مثيل SerialEM وهمية. انقر نقرا مزدوجا فوق نافذة المتصفح لفتح خريطة مربع الشبكة. البحث في الخريطة واستخدام الخيار الوهمية SerialEM الملاح إضافة نقاط لإضافة نقاط الحصول على صورة على الهدف من الاهتمام.
بعد تعيين المربعات الجديدة، حفظ ملف المستكشف ودمج الملاح مرة أخرى. استمر حتى يتم تعيين كافة مربعات الشبكة. مرة أخرى، دمج ملف المستكشف مع مثيل SerialEM وهمية.
تشغيل البرنامج النصي مخططات الظاهرية Pi EM من القائمة SerialEM وهمية. حدد الأدوات وحدد خرائط الارتساء الظاهرية. قد يستغرق ذلك بعض الوقت اعتمادا على حجم وكمية خرائط مربع الشبكة، بالإضافة إلى إعادة صياغة خرائط العرض والمعاينة.
لضمان أداء المجهر المناسب، استخدم نفس إعداد حجم التكبير والحزمة للحصول على البيانات بالترتيب التالي. تشغيل محاذاة SerialEM خالية من غيبوبة بواسطة CTF. إدراج ووسط فتحة الهدف.
تشغيل الاستجماتيزم الصحيح SerialEM بواسطة CTF و GIF لحن سريع. في SerialEM فتح ملف المستكشف الجديد. إلغاء تحديد كافة النقاط A.
حدد خرائط العرض الأولى. حدد طي. انقر على انهيار مرتين وإزالة التحديد.
حدد موضع خريطة العرض الأول. اضغط Shift T، ثم حدد موضع خريطة العرض الأخير واضغط على Shift T مرة أخرى. اختر صور إطار مفرد في خصائص الملف لفتح مربع حوار.
في مربع الحوار خصائص الملف التالي، حدد المعلمات المطلوبة وفقا لاحتياجات التصوير وإعداد الأداة. عند المطالبة، قم بإعطاء اسم برقم وانقر على الحفظ. قم بإعداد وحدة تحكم سلسلة الميل لأول موضع TS.
عند الانتهاء، انقر فوق موافق لتعيين هذه المعلمات لكافة سلسلة الميل بعد عنصر الامتلاك هذا. يتم الآن تحديد كافة مخططات المعاينة ك TS مع اسم ملف مرقم. إذا لزم الأمر، قم بتعيين مسافة التركيز/المسار لكل هدف.
انقر نقرا مزدوجا فوق خريطة العرض لتحميله. حدد خريطة المعاينة في قائمة الملاح. ثم حدد تحرير التركيز في إطار الملاح.
في لوحة التحكم ذات الجرعة المنخفضة، قم بتدوير محور الدوران بين المناطق لوضع التجربة والتركيز على طول محور إمالة المرحلة. انقر فوق المنطقة المطلوبة في خريطة العرض المحملة لتعيين موضع تجربة التركيز لسلسلة الميل هذه والتأكد من أن عنصر الملاح لديه مجموعة TSP. كرر الإجراء لكافة العناصر.
تحرير نطاق التركيز في PreTomo البرنامج النصي الذي يعمل قبل كل سلسلة الميل. في القائمة سلسلة الميل SerialEM تحقق تشغيل البرنامج النصي في TS وحدد رقم البرنامج النصي للبرنامج النصي أثناء كل إمالة. تحقق من مستوى خزان النيتروجين وما إذا كان يتم تحديد توربو محمل السيارات قبالة.
تحقق من المساحة الحرة لتخزين البيانات. في القائمة ملف SerialEM إلغاء تحديد الحفظ المستمر لملف السجل. ستحصل كل سلسلة إمالة على ملف السجل الخاص بها.
بعد النقر على الحصول على العناصر في قائمة التنقل، تشغيل PreTomo السيناريو. حدد المهمة الأساسية الحصول على سلسلة الميل، ثم حدد تشغيل البرنامج النصي بعد PostTomo. حدد صمامات العمود إغلاق في نهاية وإرسال البريد الإلكتروني في نهاية، ثم انقر على الذهاب.
تم اختيار 71 مربعا مناسبا على خريطة الشبكة عند التكبير السفلي. تم الحصول على خرائط التكبير المتوسطة مع الإعدادات التي تسمح للتصور المباشر وتحديد عينة من الاهتمام، والفيروسات التاجية في هذه الحالة. وكان وقت الاستحواذ ثلاث دقائق لكل مربع، وثلاث ساعات و45 دقيقة في المجموع.
كما تم إنشاء الخريطة المربعة الأولى، تم فتح مثيل SerialEM وهمية على جهاز كمبيوتر منفصل لتصور الخريطة المربعة وإضافة نقاط على أهداف مناسبة لاكتساب سلسلة الميل. تم إعداد جرعة منخفضة SerialEM وتم التقاط عرض المرجع وصور المعاينة وحفظها كخرائط. يمكن استخدام الخرائط الأخيرة مباشرة على مثيل SerialEM الوهمي لإنشاء طريقة العرض الظاهرية والمعاينة الظاهرية من صور الخريطة المربعة المقابلة.
تم استخدام خرائط العرض الظاهرية للتوسيط الأولي للهدف، متبوعة بتوسيط نهائي تم إجراؤه في تكبير اكتساب سلسلة الميل الفعلي باستخدام خريطة المعاينة الافتراضية. يجب على المستخدمين السماح لأنفسهم متسع من الوقت لاستكشاف المناظر الطبيعية عينة. بعد البحث في بعض الخرائط ، يطور المرء شعورا أفضل بالمناطق ذات الجودة الجيدة لجمع البيانات منها.
يفصل هذا البروتوكول سير عمل فعال لعملية استحصال بيانات التصوير المقطعي الإلكتروني المبرد (cryoET) الآلية واسعة النطاق، مع التركيز على تحقيق أقصى استفادة من وقت استخدام المجهر وتبسيط عملية اختيار أهداف الاستحصال. ومن خلال الاستفادة من برمجة SerialEM وبرمجيات PyEM، تتيح هذه الطريقة رسم خرائط الشبكة الآلية، واختيار الأهداف، واستحصال سلاسل الإمالة، مما يقلل بشكل كبير من التدخل اليدوي ووقت الإعداد.
يعد الحصول الفعال على بيانات التصوير المقطعي الإلكتروني بالتجميد (cryoET) أمراً بالغ الأهمية في البيولوجيا البنيوية عالية الدقة، مما يتيح تحليلاً ثلاثي الأبعاد سريعاً وقابلاً للتكرار للمجمعات الجزيئية الكبيرة. وتعمل تدفقات العمل المؤتمتة باستخدام SerialEM وPyEM على تبسيط عمليات رسم خرائط الشبكة واختيار الأهداف، مما يؤدي إلى تحقيق أقصى استفادة من المجهر وتقليل الاختناقات التشغيلية. وتؤثر هذه التطورات بشكل مباشر على مسارات الاكتشاف المبكر والتحقق البنيوي في أبحاث الأدوية الحيوية.&د.
يدمج سير عمل التصوير المقطعي الإلكتروني المبرد (cryoET) المؤتمت هذا المراحل بدءاً من الاكتشاف المبكر وصولاً إلى تحديد المركبات الرائدة والأبحاث قبل السريرية، مما يدعم اختبار الفرضيات الهيكلية والحد من المخاطر المتعلقة بالأهداف.