التمايز الموجه للخلايا البطانية الدموية من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات
مارس 31, 2021
يعرض هنا بروتوكول بسيط للتمايز الموجه للخلايا البطانية الدموية من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات في حوالي 1 أسبوع.
يفصل هذا البروتوكول طريقة لتوليد مجموعة مميزة جيدا من الخلايا البطانية البشرية المولدة للدم. يمكن استخدام هذه الخلايا لدراسة التنظيم الجزيئي والانتقال من البطانة إلى المكونة للدم. ابدأ بزراعة الخلايا الجذعية الجنينية البشرية لمدة أربعة أيام لتمييزها إلى خلايا بطانية بدائية.
في اليوم الخامس ، استنشاق الوسط فوق الخلايا. ثم اغسل الخلايا برفق باستخدام ملليلتر واحد من DMEM / F-12 لكل بئر. أضف ملليلتر واحد من وسط تمايز الخلايا البطانية الدموية الطازج لكل بئر واحتضان الخلايا لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
في اليوم السادس واليوم السابع ، استبدل الوسط فوق الخلايا بملليلتر واحد من وسط تمايز الخلايا البطانية المتجانسة المعد حديثا لكل بئر ، واحتضان الخلايا لمدة 24 ساعة أخرى. في اليوم الثامن. بعد فصل الخلايا وغسلها ، قسمها بالتساوي إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة على الجليد ، يحتوي كل منها على ما لا يقل عن 600 ميكرولتر من الخلايا بكثافة 1 مرة 10 إلى 5 خلايا لكل ملليلتر.
أضف الأجسام المضادة إلى الأنابيب التي تحتوي على خلايا حسب الاقتضاء واحتضانها على ثلج محمي من الضوء لمدة 30 دقيقة. قم بتكوير الخلايا بالطرد المركزي عند 1000 مرة G و 4 درجات مئوية لمدة خمس دقائق. قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق الكريات في 600 ميكرولتر من مخزن الفرز البارد المثلج.
قم بتصفية العينات من خلال غطاء المرشح الشبكي لأنابيب FACS سعة خمسة ملليلتر وقم بتخزين الخلايا على الجليد المحمي من الضوء لفرز الخلايا على الفور. لعزل الخلايا البطانية الدموية بواسطة FACS ، قم أولا ببوابة مجموعة الخلايا السلبية CD45. ثم داخل المجتمع الإحصائي السلبي CD45 ، قم ببوابة الخلايا الإيجابية CD31.
التالي ضمن السكان الإيجابيين CD31 ، بوابة لمجتمع الخلايا السلبية VE-cadherin. ثم داخل السكان سلبي VE-cadherin ، بوابة للخلايا الإيجابية c-Kit. من السكان الإيجابيين c-Kit ، قم ببوابة مجتمع الخلايا الإيجابي CD34.
وأخيرا من مجتمع الخلايا الإيجابية CD34 ، حدد الخلايا الإيجابية KDR واجمعها. بعد بذر الخلايا البطانية الدموية في وسط قائم على ميثيل سلولوز تمت صياغته لنمو الخلايا السلفية المكونة للدم ، يتم حساب مستعمرات تشكيل وحدة الإريثرويد ، ومستعمرات تشكيل الانفجار - مستعمرات الإريثرويد في اليوم الثامن. وحدة تشكيل المستعمرة - الخلايا المحببة - البلاعم ووحدة تشكيل المستعمرات - المحببة ، الكريات الحمراء ، الضامة ، والخلايا الضخمة.
يتم حساب مستعمرات السلف المكونة للدم متعددة القدرات في اليوم 14. لكل 1000 خلية بطانية دموية مطلية ، يتم إنشاء ما يقرب من 20 وحدة تشكيل مستعمرة. الخلايا ذات مورفولوجيا الخلايا البطانية مرئية أيضا في الثقافات.
هذه هي الخلايا البطانية الدموية التي تؤدي إلى أسلاف المكونة للدم متعددة السلالات على مستوى خلية واحدة. هذا البروتوكول عبارة عن مصل 2D ونظام ثقافة خال من تغذية الفئران يمكنه توليد خلايا بطانية بشرية في أسبوع واحد تقريبا.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة بروتوكولاً مفصلاً لاشتقاق الخلايا البطانية المكونة للدم من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية في غضون أسبوع واحد تقريباً. تمكّن هذه الطريقة الباحثين من توليد مجموعة محددة الخصائص من هذه الخلايا، والتي تُعد ضرورية لدراسة الانتقال من الخلايا البطانية إلى المكونة للدم، ولها تطبيقات محتملة في الطب التجديدي وإنتاج مشتقات الدم.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- بيولوجيا الخلايا الجذعية
- بيولوجيا الأوعية الدموية
- تكوين الدم
- هندسة الأنسجة
خلفية علمية
- تُعد الأوعية الدموية ضرورية لوظائف الأنسجة، وهي مبطنة بخلايا بطانية وعائية.
- تعتبر الخلايا البطانية المكونة للدم نوعاً فرعياً متخصصاً ينشأ منه الخلايا الجذعية والطلائعية المكونة للدم أثناء التطور.
- إن توليد هذه الخلايا في المختبر أمر قيم لدراسة تطور خلايا الدم وللتطبيقات العلاجية المحتملة.
- لا تؤدي البروتوكولات الحالية لاشتقاق الخلايا البطانية إلى إنتاج خلايا بطانية مكونة للدم محددة الخصائص بدقة من الخلايا الجذعية البشرية.
الغرض من الدراسة
- وضع بروتوكول قابل للتكرار لتوليد الخلايا البطانية المكونة للدم من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية.
- تمكين دراسة التنظيم الجزيئي والانتقال من الخلايا البطانية إلى الخلايا المكونة للدم في المختبر.
- توفير نظام خالٍ من الخلايا المغذية وخالٍ من المصل يكون مناسباً للتطبيقات اللاحقة.
الطرق المستخدمة
- زراعة الخلايا الجذعية الجنينية البشرية والتمايز التدريجي على مدار ثمانية أيام.
- تحفيز سلالات الأديم المتوسط والخلايا البطانية باستخدام عوامل نمو وجزيئات صغيرة محددة (مثل مثبط GSK3β، وbFGF، وBMP4، وVEGF-A، وحمض الريتينويك).
- قياس التدفق الخلوي (FACS) لعمليات البوابة المتتالية وعزل الخلايا البطانية المكونة للدم بناءً على العلامات السطحية (CD45-، وCD31+، وVE-cadherin-، وc-Kit+، وCD34+، وKDR+).
- التقييم الوظيفي عبر مقايسات تكوين المستعمرات في وسط قائم على الميثيل سليلوز لتقييم القدرة على تكوين الدم.
النتائج الرئيسية
- ينتج عن هذا البروتوكول مجموعة محددة من الخلايا البطانية المكونة للدم في غضون أسبوع واحد.
- يتم إنتاج ما يقرب من 20 وحدة مكونة للمستعمرات لكل 1000 خلية بطانية مكونة للدم، مما يشير إلى قدرة قوية على تكوين الدم.
- يتم رصد مستعمرات من السلائف المكونة للدم متعددة القدرات والسلائف الحمراء.
- يتم الحفاظ على مورفولوجيا الخلايا البطانية في المزرعة، مما يؤكد هوية الخلايا.
الاستنتاجات
- يؤدي هذا البروتوكول الخالي من الخلايا المغذية والخالي من المصل إلى توليد الخلايا البطانية المكونة للدم البشرية بكفاءة من الخلايا الجذعية الجنينية.
- تسهل هذه الطريقة الدراسات المختبرية للتحول من الخلايا البطانية إلى الخلايا المكونة للدم والتنظيم الجزيئي.
- توفر هذه الطريقة منصة محتملة لتوليد منتجات الدم خارج الجسم، مما يقلل الاعتماد على المتبرعين البشر.
الأسئلة الشائعة
الأهمية التنفيذية في القطاع الصناعي
يعالج التمايز الموجه للخلايا البطانية المكونة للدم من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات عنق زجاجة حرج في نمذجة التطور المكون للدم وتوليد السلالات الدموية خارج الجسم. تمكّن هذه القدرة من تقليل المخاطر الميكانيكية المرتبطة بالانتقال من الحالة البطانية إلى الحالة المكونة للدم، وتعزز الثقة التنبؤية في مسارات العلاج الخلوي والطب التجديدي في مراحلها المبكرة. كما يعزز تصميم البروتوكول الخالي من الخلايا المغذية والخالي من المصل من إمكانية التكرار وقابلية التوسع لمحافظ البحث والتطوير في المؤسسات.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- يُمكِّن من استقصاء المسارات الجزيئية التي تحكم عملية التحول من الخلايا البطانية إلى الخلايا المكونة للدم.
- يدعم التحقق الوظيفي من الأهداف بالنسبة للعوامل المؤثرة في تحديد سلالة الدم.
- يسهل التقييم التنبؤي للمخاطر فيما يخص الأهداف المرشحة في التطور المكون للدم.
الفحص وتطوير المقايسة
- يوفر مجموعة خلوية معيارية ومحددة الخصائص جيداً للمقايسات الوظيفية اللاحقة.
- يتيح التقييم الكمي لتكوين المستعمرات المكونة للدم من سلفيات محددة.
- يدعم الفرز القابل للتكرار للمعدلات التي تؤثر على المصير البطاني أو المكون للدم.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- تؤسس منصة لنمذجة العيوب المكونة للدم ذات الصلة بالأمراض في المختبر (in vitro).
- تتيح الاستمرارية من مرحلة الاكتشاف إلى التحقق قبل السريري من استراتيجيات توليد خلايا الدم.
- تدعم التقدم المدروس والمعدل وفقاً للمخاطر لمفاهيم العلاجات القائمة على الخلايا.
تكامل خطوط المعالجة وسير العمل
يُدمج هذا البروتوكول ضمن التسلسل الممتد من مرحلة الاكتشاف إلى المرحلة قبل السريرية، وذلك من خلال تمكين التوليد والعزل القوي للخلايا البطانية المكونة للدم من أجل الدراسات الآلية والمقايسات الوظيفية.
- بيولوجيا الاكتشاف: يدعم اختبار الفرضيات المتعلقة بالتنظيم الجزيئي لظهور سلالات الدم.
- الفحص المسحي: يقدم مخرجات كمية قابلة للتكرار لتكوين المستعمرات من أجل التحليل المقارن.
- التحليلات: يوفر تحديد البوابات القائم على قياس التدفق الخلوي وتقدير عدد المستعمرات للحصول على قراءات موضوعية.
- الأبحاث الانتقالية: يربط بين النمذجة في المختبر والتقييم قبل السريري للإمكانات المكونة للدم.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: يوفر نظاماً قابلاً للتطوير وخالياً من الخلايا المغذية يمكن تكييفه عبر خطوط الخلايا الجذعية ونماذج الأمراض.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تزيد من الثقة التنبؤية في نمذجة السلالات المكونة للدم والتحقق من الأهداف.
- القيمة التشغيلية: تعزز التقييس، وقابلية التكرار، وقابلية التوسع في سير عمل تمايز الخلايا.
- القيمة الاستراتيجية: تحسن عملية اتخاذ قرارات المضي قدماً أو التوقف لبرامج العلاج الخلوي والطب التجديدي.
- تأثير المحفظة: تتيح تحديد الأولويات المعدلة حسب المخاطر للمرشحين العلاجيين القائمين على الخلايا في المراحل المبكرة.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في زراعة الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات وبروتوكولات تمايزها.
- يستلزم الوصول إلى أجهزة قياس التدفق الخلوي لفرز الخلايا متعدد المعلمات.
- يقتضي توحيد استراتيجيات تحديد البوابات وقياس المستعمرات بين الفرق المختلفة.
- قابل للتكيف مع مختلف خطوط الخلايا الجذعية البشرية من خلال تحسين البروتوكول.
- يعتمد على لوحات أجسام مضادة معتمدة واختبارات وظيفية قائمة على الميثيل سليلوز.
