التمايز الموجه للخلايا البطانية الدموية من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات
مارس 31, 2021
يعرض هنا بروتوكول بسيط للتمايز الموجه للخلايا البطانية الدموية من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات في حوالي 1 أسبوع.
يفصل هذا البروتوكول طريقة لتوليد مجموعة مميزة جيدا من الخلايا البطانية البشرية المولدة للدم. يمكن استخدام هذه الخلايا لدراسة التنظيم الجزيئي والانتقال من البطانة إلى المكونة للدم. ابدأ بزراعة الخلايا الجذعية الجنينية البشرية لمدة أربعة أيام لتمييزها إلى خلايا بطانية بدائية.
في اليوم الخامس ، استنشاق الوسط فوق الخلايا. ثم اغسل الخلايا برفق باستخدام ملليلتر واحد من DMEM / F-12 لكل بئر. أضف ملليلتر واحد من وسط تمايز الخلايا البطانية الدموية الطازج لكل بئر واحتضان الخلايا لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
في اليوم السادس واليوم السابع ، استبدل الوسط فوق الخلايا بملليلتر واحد من وسط تمايز الخلايا البطانية المتجانسة المعد حديثا لكل بئر ، واحتضان الخلايا لمدة 24 ساعة أخرى. في اليوم الثامن. بعد فصل الخلايا وغسلها ، قسمها بالتساوي إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة على الجليد ، يحتوي كل منها على ما لا يقل عن 600 ميكرولتر من الخلايا بكثافة 1 مرة 10 إلى 5 خلايا لكل ملليلتر.
أضف الأجسام المضادة إلى الأنابيب التي تحتوي على خلايا حسب الاقتضاء واحتضانها على ثلج محمي من الضوء لمدة 30 دقيقة. قم بتكوير الخلايا بالطرد المركزي عند 1000 مرة G و 4 درجات مئوية لمدة خمس دقائق. قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق الكريات في 600 ميكرولتر من مخزن الفرز البارد المثلج.
قم بتصفية العينات من خلال غطاء المرشح الشبكي لأنابيب FACS سعة خمسة ملليلتر وقم بتخزين الخلايا على الجليد المحمي من الضوء لفرز الخلايا على الفور. لعزل الخلايا البطانية الدموية بواسطة FACS ، قم أولا ببوابة مجموعة الخلايا السلبية CD45. ثم داخل المجتمع الإحصائي السلبي CD45 ، قم ببوابة الخلايا الإيجابية CD31.
التالي ضمن السكان الإيجابيين CD31 ، بوابة لمجتمع الخلايا السلبية VE-cadherin. ثم داخل السكان سلبي VE-cadherin ، بوابة للخلايا الإيجابية c-Kit. من السكان الإيجابيين c-Kit ، قم ببوابة مجتمع الخلايا الإيجابي CD34.
وأخيرا من مجتمع الخلايا الإيجابية CD34 ، حدد الخلايا الإيجابية KDR واجمعها. بعد بذر الخلايا البطانية الدموية في وسط قائم على ميثيل سلولوز تمت صياغته لنمو الخلايا السلفية المكونة للدم ، يتم حساب مستعمرات تشكيل وحدة الإريثرويد ، ومستعمرات تشكيل الانفجار - مستعمرات الإريثرويد في اليوم الثامن. وحدة تشكيل المستعمرة - الخلايا المحببة - البلاعم ووحدة تشكيل المستعمرات - المحببة ، الكريات الحمراء ، الضامة ، والخلايا الضخمة.
يتم حساب مستعمرات السلف المكونة للدم متعددة القدرات في اليوم 14. لكل 1000 خلية بطانية دموية مطلية ، يتم إنشاء ما يقرب من 20 وحدة تشكيل مستعمرة. الخلايا ذات مورفولوجيا الخلايا البطانية مرئية أيضا في الثقافات.
هذه هي الخلايا البطانية الدموية التي تؤدي إلى أسلاف المكونة للدم متعددة السلالات على مستوى خلية واحدة. هذا البروتوكول عبارة عن مصل 2D ونظام ثقافة خال من تغذية الفئران يمكنه توليد خلايا بطانية بشرية في أسبوع واحد تقريبا.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة بروتوكولاً مفصلاً لاشتقاق الخلايا البطانية المكونة للدم من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية في غضون أسبوع واحد تقريباً. تمكن هذه الطريقة الباحثين من توليد مجموعة محددة الخصائص من هذه الخلايا، والتي تُعد ضرورية لدراسة التحول من الخلايا البطانية إلى الخلايا المكونة للدم، ولها تطبيقات محتملة في الطب التجديدي وإنتاج مشتقات الدم.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- بيولوجيا الخلايا الجذعية
- بيولوجيا الأوعية الدموية
- تكون الدم
- هندسة الأنسجة
خلفية علمية
- تعد الأوعية الدموية ضرورية لوظائف الأنسجة، وهي مبطنة بخلايا بطانية وعائية.
- تعتبر الخلايا البطانية المكونة للدم نوعاً فرعياً متخصصاً يعطي نشأة للخلايا الجذعية والسلفية المكونة للدم أثناء التطور.
- إن توليد هذه الخلايا في المختبر أمر ذو قيمة لدراسة تطور خلايا الدم وللتطبيقات العلاجية المحتملة.
- لا تؤدي البروتوكولات الحالية لاشتقاق الخلايا البطانية إلى إنتاج خلايا بطانية مكونة للدم محددة الخصائص بدقة من الخلايا الجذعية البشرية.
الغرض من الدراسة
- تأسيس بروتوكول قابل للتكرار لتوليد خلايا بطانية مكوّنة للدم من خلايا جذعية جنينية بشرية.
- تمكين دراسة التنظيم الجزيئي والتحول من الخلايا البطانية إلى الخلايا المكونة للدم في المختبر.
- توفير نظام خالٍ من الخلايا المغذية وخالٍ من المصل، يكون مناسباً للتطبيقات اللاحقة.
الطرق المستخدمة
- زراعة الخلايا الجذعية الجنينية البشرية والتمايز التدريجي على مدار ثمانية أيام.
- تحفيز سلالات الأديم المتوسط والخلايا البطانية باستخدام عوامل نمو وجزيئات صغيرة محددة (مثل مثبط GSK3β، وbFGF، وBMP4، وVEGF-A، وحمض الريتينويك).
- قياس التدفق الخلوي (FACS) للتجزئة التسلسلية وعزل الخلايا البطانية المكونة للدم استنادًا إلى واسمات السطح (CD45-، CD31+، VE-cadherin-، c-Kit+، CD34+، KDR+).
- التقييم الوظيفي عبر فحوصات تكوين المستعمرات في وسط قائم على الميثيل سليلوز لتقييم القدرة المكونة للدم.
النتائج الرئيسية
- ينتج عن هذا البروتوكول مجموعة محددة من الخلايا البطانية المكونة للدم في غضون أسبوع واحد.
- يتم إنتاج ما يقرب من 20 وحدة مكونة للمستعمرات لكل 1000 خلية بطانية مكونة للدم، مما يشير إلى إمكانات مكونة للدم قوية.
- لوحظ وجود مستعمرات من السلائف المكونة للدم متعددة القدرات وكذلك السلائف المكونة للكريات الحمراء.
- يتم الحفاظ على مورفولوجيا الخلايا البطانية في المزرعة، مما يؤكد هوية الخلايا.
الاستنتاجات
- يولد هذا البروتوكول، الخالي من الخلايا المغذية والمصل، خلايا بطانية مكونة للدم بشرية بكفاءة من الخلايا الجذعية الجنينية.
- تسهل هذه الطريقة الدراسات المخبرية لعملية الانتقال من الخلايا البطانية إلى الخلايا المكونة للدم والتنظيم الجزيئي.
- توفّر هذه الطريقة منصة لاحتمالية توليد منتجات دموية خارج الجسم الحي، مما يقلل الاعتماد على المتبرعين البشريين.
الأسئلة الأكثر شيوعاً
الأهمية التنفيذية للصناعة
يعالج التمايز الموجه للخلايا البطانية المكونة للدم من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات عقبة حرجة في نمذجة التطور المكون للدم وتوليد سلالات الدم خارج الجسم. وتتيح هذه القدرة تقليل المخاطر الميكانيكية للتحول من الخلايا البطانية إلى الخلايا المكونة للدم، كما تعزز الثقة التنبؤية في مسارات العلاج الخلوي والطب التجديدي في مراحلها المبكرة. ويساهم تصميم البروتوكول الخالي من الخلايا المغذية والخالي من المصل في تحسين قابلية التكرار والقابلية للتوسع لمحافظ البحث والتطوير في المؤسسات.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من صحة الهدف
- يتيح استقصاء المسارات الجزيئية التي تحكم الانتقال من الخلايا البطانية إلى الخلايا المكونة للدم.
- يدعم التحقق الوظيفي من الأهداف للعوامل التي تؤثر على تخصيص السلالة الدموية.
- يسهل تقليل المخاطر التنبؤي للأهداف المرشحة في تطور تكوين الدم.
الفحص وتطوير المقايسة
- يوفر مجموعة خلوية قياسية وموصوفة جيداً للاختبارات الوظيفية اللاحقة.
- يتيح التقييم الكمي لتكوين المستعمرات المكونة للدم من أسلاف محددة.
- يدعم الفحص القابل للتكرار للمعدِّلات التي تؤثر على المصير البطاني أو المكون للدم.
الأبحاث الترجمية وما قبل السريرية
- تأسيس منصة لنمذجة العيوب المكونة للدم ذات الصلة بالأمراض في المختبر.
- تمكين الاستمرارية من مرحلة الاكتشاف إلى التحقق قبل السريري من استراتيجيات توليد خلايا الدم.
- دعم التقدم المعدل حسب المخاطر للمفاهيم العلاجية القائمة على الخلايا.
تكامل سير العمل ومسار المعالجة
يدمج هذا البروتوكول في التسلسل الممتد من مرحلة الاكتشاف إلى المرحلة ما قبل السريرية من خلال تمكين التوليد والعزل القوي للخلايا البطانية المكونة للدم لإجراء الدراسات الميكانيكية والمقاييس الوظيفية.
- بيولوجيا الاكتشاف: تدعم اختبار الفرضيات المتعلقة بالتنظيم الجزيئي لظهور السلالات الدموية.
- الفحص: توفر نتائج كمية قابلة للتكرار لتشكيل المستعمرات من أجل التحليل المقارن.
- التحليلات: توفر تحديد البوابات القائم على قياس التدفق الخلوي وكمية المستعمرات للحصول على قراءات موضوعية.
- الأبحاث الانتقالية: تربط بين النمذجة المختبرية والتقييم قبل السريري للإمكانات المكونة للدم.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: توفر نظاماً قابلاً للتطوير وخالياً من الخلايا المغذية يمكن تكييفه عبر خطوط الخلايا الجذعية ونماذج الأمراض.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تزيد من الثقة التنبؤية في نمذجة السلالات المكونة للدم والتحقق من الأهداف.
- القيمة التشغيلية: تعزز التوحيد القياسي وقابلية التكرار وقابلية التوسع في سير عمل تمايز الخلايا.
- القيمة الاستراتيجية: تحسن عملية اتخاذ قرارات المضي قدماً أو التوقف (go/no-go) في برامج العلاج الخلوي والطب التجديدي.
- التأثير على المحفظة: تتيح تحديد الأولويات المعدلة حسب المخاطر للمرشحين العلاجيين المعتمدين على الخلايا في المراحل المبكرة.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في زراعة الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات وبروتوكولات تمايزها.
- يستلزم الوصول إلى أجهزة قياس التدفق الخلوي لفرز الخلايا متعدد المعلمات.
- يقتضي توحيد استراتيجيات تحديد البوابات (gating strategies) وقياس مستعمرات الخلايا بين الفرق البحثية.
- قابل للتطبيق على مختلف خطوط الخلايا الجذعية البشرية مع تحسين البروتوكول.
- يعتمد على لوحات أجسام مضادة مصدق عليها ومقايسات وظيفية قائمة على الميثيل سيلولوز.
