الدقة قص شرائح الرئة كأداة فعالة لهيكل الأوعية الرئوية في الجسم الحي السابق ودراسات الانقباض
May 24th, 2021
يقدم هنا بروتوكول للحفاظ على انقباض الأوعية الدموية لأنسجة الرئة المورين PCLS ، مما يؤدي إلى صورة ثلاثية الأبعاد متطورة للمجرى الوعائي الرئوي والمجرى الهوائي ، والتي يمكن الحفاظ عليها لمدة تصل إلى 10 أيام عرضة للعديد من الإجراءات.
وستحافظ طريقة قطع شرائح الرئة الدقيقة على الهيكل والتوجهات المكانية في ثلاثة أبعاد دون تحيز إقليمي ويمكن أن تكون بمثابة نموذج بديل حي للسفن وقياسات انقباض مجرى الهواء. بالاقتران مع التصوير الفاصل الزمني ، واللطخة الغربية ، وتحليل الحمض النووي الريبي ، تساهم شرائح الرئة المقطوعة بدقة في الفهم الشامل لسلاسل الإشارات التي تكمن وراء مجموعة واسعة من الاضطرابات وتؤدي إلى فهم أفضل للفيزيولوجيا المرضية في أمراض الأوعية الدموية الرئوية. للبدء، ضع الماوس البالغ القتل الرحيم في وضع ية وآمنة في مكانها عن طريق تسجيل الكفوف والأنف إلى الطاولة مع شريط لاصق.
رش سطح البطن من الماوس مع 70٪ الإيثانول. استخدم ملقط لرفع جلد البطن من الماوس في موقع المثانة ومقص الجراحية لقطع في خط الوسط، والانتقال بشكل متفوق إلى منطقة عنق الرحم لفضح القصبة الهوائية. ثم استخدم الملاقط لرفع طبقة اللفافة الأساسية واستخدام مقص الجراحية لفضح الأعضاء الحشوية ومقصورة الوسطين، وقطع مرة أخرى أقل شأنا إلى متفوقة.
قطع القص في منتصف الخط لفضح القلب والرئة. تشريح الحجاب الحاجز بعناية من الكبد ومقصورة البطن. تحديد موقع كافا الوريد السفلي تحت الأمعاء وقطع عليه.
بعد تحديد موقع البطين الأيمن، استخدم إبرة فراشة قياس 25 إلى 30 لحقن 0.5 ملليلتر من الهيبارين 1٪ مجزأة في البطين الأيمن وتدفق ببطء ولكن بثبات مع 10 إلى 15 ملليمتر من برنامج تلفزيوني. بعد تحديد موقع الحنجرة، استخدم ملاقط طرف حادة لتشريح اللفافة المحيطة والأنسجة، ثم وضع خياطة الجراحية تحت القصبة الهوائية وربط فضفاضة عقدة الجراحية. وضع ثقب صغير في القصبة الهوائية متفوقة على السلسلة و cannulate مع إبرة قياس 20 حادة النهاية.
شد الغرز حول الإبرة والقرصة باستخدام عقدة جراحية. ثم حقن 2.5 إلى 4 ملليلتر من الآغاروز في القصبة الهوائية ورصد التضخم في الرئة. بعد حقن agarose، صب برنامج تلفزيوني الباردة على الرئة لترسيخ agarose.
ثم قطع القصبة الهوائية متفوقة على خياطة الجراحية وتشريح الرئة والقلب من mediastinum عن طريق إزالة أي التصاقات واللفافة. بعد التجسيد، ضع الأنسجة في DMEM في طبق بيتري على الجليد، والمضي قدما على الفور إلى تشريح فص واحد باستخدام آلة هزاز. لإعداد شرائح الرئة، قم بإرفاق العينة بالمنصة مع الغراء الفائق، مع الحفاظ على الجانب الوسيط الذي يواجه.
ثم ملء حاوية عينة مع برنامج تلفزيوني. ملء الحاوية مع الجليد للحفاظ على برنامج تلفزيوني المحيطة وعينة الباردة. تشغيل الهزاز.
ضبط سمك إلى 300 ميكرومتر، والتردد إلى 100 هيرتز، والسعة إلى 0.6 ملليمتر، والسرعة إلى خمسة ميكرومتر في الثانية الواحدة. باستخدام وجع ألين، قم بتحويل حامل النصل إلى الوضع الآمن وافتح الفكين لإدخال شفرة. ثم تشديد الفكين مع وجع ألن.
ضع العينة على الصندوق، وتأكد من غمرها في برنامج تلفزيوني. حرك المربع لأعلى في الموضع الصحيح وتأكد من أنه آمن. تحويل حامل النصل إلى الموضع المناسب للتقطيع.
جلب شفرة الهزاز تصل إلى حافة الكتلة وخفض يدويا شفرة حتى يكون حتى مع الجزء العلوي من العينة. تأكد من الإعدادات وتشغيل الهزاز. بعد قطع الشرائح الطازجة، قم بإزالة العينات من برنامج تلفزيوني ووضعها في طبق بيتري معقم مع 10 ملليلترات من DMEM تحتوي على مضاد حيوي مضاد للميكوزيلمرة واحدة.
بعد وضع جميع الشرائح في طبق بيتري، تراجع عن النصل تماما واستخدم مفتاح ألين لرفع النصل إلى وضع آمن. تخزين العينات في DMEM في 37 درجة مئوية. ووضع شريحة هزاز على شريحة المجهر.
استخدم مسح التنظيف لإزالة الوسط الزائد. ضع العينة على المجهري التباين المرحلة واستخدام 10 إلى 20X التكبير لتحديد السفينة. ثم أضف 500 ميكرولتر من أجهزة الأوعية الدموية، مثل كلوريد البوتاسيوم 60 ملليمولار أو واحد الاندوثين-1 ميكرومولار لغمر الشريحة تماما.
مراقبة والتقاط الفيديو عن طريق تسجيل لمدة 30 إلى 60 ثانية. قبل بدء التجربة، قم بملء صندوق رغوة البوليسترين الصغير بلتر واحد من النيتروجين السائل ووضع أنبوبين للطرد المركزي الدقيق سعة 1.5 ملليلتر في الحاوية بالنيتروجين السائل. ضع أربع إلى خمس شرائح هزاز طازجة في وعاء هاون.
صب 5 إلى 10 ملليلتر من النيتروجين السائل على رأس شرائح واستخدام الحشرات بسرعة لطحن شرائح إلى مسحوق قبل أن يتبخر النيتروجين السائل. استخدام مغرفة مختبر الصلب المبردة مسبقا لغرف مسحوق في اثنين من أنابيب الطرد الدقيق المبردة وتحلل مسحوق بإضافة 500 ميكرولتر من كاشف استخراج الحمض النووي الريبي لعزل الحمض النووي الريبي أو 500 ميكرولتر من العازلة RIPA لتحلل البروتين. في تجربة الجدوى التمثيلية ، تم الكشف عن تغيير لون شرائح PCLS من اليوم صفر إلى يوم واحد واليوم التاسع إلى العاشر.
كان الحل أزرق في البداية وتحول إلى اللون الوردي بين عشية وضحاها ، مما يدل على الجدوى. يحدث تغيير اللون عادة في غضون ساعة إلى أربع ساعات، ولكن قد يكون من الضروري وقتا أطول. يظهر الفرق اليومي بين الامتصاص عند أطوال موجية 562 و613 نانومتر للأنسجة المحضرة بالهزاز هنا.
يمكن تصور انقباض الأوعية الدموية في أنسجة الرئة المعدة للهزاز باستخدام الإندوتيلين-1 وكلوريد البوتاسيوم هنا. الحفاظ على وضع العلامات tdTomato في الخلايا بعد أسبوع واحد من حقن تاموكسيفين هو واضح في هذه الشرائح الرئة. من المهم للغاية إجراء تطهير الرئة والتضخم خطوة جيدة لإزالة جميع الدم من الدورة الدموية قبل إجراء تجارب إضافية والتصوير.
بالإضافة إلى أمراض الأوعية الدموية ، يمكن تطبيق PCLS لدراسة علم الأحياء الطبيعية للأمراض المرتبطة بالجوي ، ويمكن إجراء المزيد من الاختبار على أنسجة الرئة البشرية في السيناريوهات ذات الصلة سريريا.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
يقدم هذا المقال بروتوكولاً لحفظ انقباض الأوعية الدموية في شرائح الرئة المقطعة بدقة (PCLS) من أنسجة الرئة الفأرية. تتيح هذه الطريقة تصويرًا متطورًا ثلاثي الأبعاد للأوعية الدموية والجهاز التنفسي، والتي يمكن الحفاظ عليها لمدة تصل إلى 10 أيام وتكون قابلة لمختلف الإجراءات التجريبية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- بحوث الأوعية الدموية الرئوية
- البيولوجيا التجريبية
الخلفية
- تحافظ شرائح الرئة المقطعة بدقة على النزاهة الهيكلية والتوجيه المكاني.
- تتجنب هذه الطريقة التحيز الإقليمي في قياسات الانقباض.
- تعمل PCLS كنموذج بديل حي لدراسة أمراض الأوعية الدموية الرئوية.
- تعزز التصوير الزمني والتحليلات الجزيئية فهم آليات المرض.
هدف الدراسة
- تطوير طريقة موثوقة لحفظ انقباض أنسجة الرئة.
- تسهيل دراسة مسارات الإشارات في الاضطرابات الرئوية.
- تحسين فهم الفيزيولوجيا المرضية في أمراض الأوعية الدموية الرئوية.
الطرق المستخدمة
- تحضير شرائح الرئة المقطعة بدقة من الفئران البالغة الميتة.
- استخدام التصوير الزمني للمراقبة الديناميكية.
- تحليل Western blot وتحليل RNA للتوصيف الجزيئي.
- حفظ الشرائح لمدة تصل إلى 10 أيام لإجراءات تجريبية.
النتائج الرئيسية
- حفظ ناجح لانقباض الأوعية الدموية في PCLS.
- يكشف التصوير ثلاثي الأبعاد عن بنية رئوية مفصلة.
- تتيح الطريقة تحليلًا شاملاً للانقباض ومسارات الإشارات.
- تساهم في فهم آليات أمراض الأوعية الدموية الرئوية.
الخلاصات
- يوفر البروتوكول أداة قيمة لأبحاث الرئة.
- يمكن استخدام PCLS في مختلف الأساليب التجريبية.
- تعزز هذه الطريقة دراسة أمراض الأوعية الدموية الرئوية.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Precision-cut lung slices (PCLS) provide a physiologically relevant ex vivo platform for evaluating pulmonary vessel structure and contractility, addressing key challenges in preserving native tissue architecture and function. This method enables integrated imaging, functional assays, and molecular analyses, supporting predictive confidence in early-stage pulmonary drug discovery. PCLS enhances translational continuity and de-risking for portfolio decisions in pulmonary vascular and airway disease research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of pulmonary vessel contractility and signaling pathways in a preserved tissue context.
- Supports biological de-risking by maintaining three-dimensional lung architecture and cellular composition.
- Facilitates functional target validation through live imaging and response to vasoconstrictors.
- Improves predictive confidence for advancing pulmonary targets in the discovery pipeline.
Screening & Assay Development
- Provides validated ex vivo lung tissue for reproducible contractility and viability assays.
- Enables quantitative measurement of vessel responses to pharmacological agents using time-lapse imaging.
- Supports assay standardization and scalability for compound evaluation in pulmonary research.
- Allows for integration with molecular analyses such as RNA and protein extraction.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models for studying pulmonary vascular and airway pathophysiology.
- Maintains translational biomarker continuity by enabling visualization of genetically labeled cells.
- Facilitates risk-adjusted advancement decisions through comprehensive functional and molecular readouts.
- Supports adaptation to human lung tissue for clinically relevant research scenarios.
Pipeline & Workflow Integration
PCLS fits within the discovery continuum from early target validation through preclinical research, enabling integrated functional and molecular analyses of pulmonary tissues.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification in a physiologically relevant lung model.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative contractility and viability outputs for compound assessment.
- Analytics: Provides real-time imaging, absorbance measurements, and molecular data for robust condition comparison.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical validation with disease-relevant tissue and biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable ex vivo platform adaptable to various pulmonary research needs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in pulmonary target validation.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of lung tissue assays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing comprehensive functional and molecular data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of pulmonary disease programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine lung dissection, tissue handling, and vibratome operation.
- Needs access to confocal microscopy, time-lapse imaging, and molecular analysis infrastructure.
- Demands cross-team standardization for tissue preparation and assay protocols.
- Adaptable to both murine and human lung tissues for broader translational relevance.
- Dependent on precise lung inflation and blood removal for optimal imaging and assay quality.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:49
Extraction of Mouse Lung
3:34
Precision Cut Lung Slices (PCLS)
5:35
Vasoconstrictor Experiment
6:20
Preparing the Tissue for RNA or Protein Lysis on PCLS
7:26
Results: Ex Vivo Pulmonary Vessel Structure and Contractility Studies of PCLS
8:32
Conclusion
