النيوترون تدور صدى الطيف كمسبار فريد لديناميات الغشاء الدهني والتفاعلات الغشاء البروتين

يصف هذا البروتوكول إعداد العينات وتقليل البيانات المطلوبة لنجاح دراسات صدى الدوران النيوتروني لتقلبات الأغشية الجماعية ذات الصلة بالمهام البيولوجية والتطبيقات العملية للأغشية الدهنية. NSE يصل مباشرة ديناميات الغشاء على الجداول الزمنية نانو ثانية من وظائف الغشاء الرئيسية مع ميزة فريدة من حساسية النظائر للتحقيق ميزات الغشاء الانتقائي لا يمكن الوصول إليها مع تقنيات أخرى. دراسات ديناميات الأغشية على مقياس النانو ضرورية لفهم خصائص الغشاء الكامنة في الآلية الجزيئية والتفاعلات بين الغشاء والبروتين المتورطين في أمراض الخلايا المختلفة.

توفر هذه الطريقة للباحثين الجدد في NSE إرشادات مفصلة حول تصميم وإعداد وتوصيف الحويصلات الدهنية للتجارب الناجحة وتحليل وتفسير تقليل البيانات اللاحقة. وسيتجلى فى العملية تيشانى كوماراج وجولى نجوين طالبة دراسات عليا وطالبة جامعية من المختبر . العمل داخل غطاء محرك السيارة، وإعداد تعليق الدهون عن طريق حل الدهون وزنها بدقة في ملليلتر واحد من المذيبات مع خلط يدوي.

جفف محلول الدهون عن طريق بث غاز خامل برفق في القارورة أثناء تدويره ببطء بزاوية. لإزالة المذيب المتبقية جيدا، ضع القنينات بين عشية وضحاها في فرن فراغ في 35 درجة مئوية. في اليوم التالي، هيدرات الفيلم الدهون مع اثنين من ملليلتر من الماء الثقيل للحصول على تركيز الدهون من 50 ملليغرام لكل ملليلتر ودوامة تعليق الدهون رطب حتى يتم حل الفيلم الدهون تماما.

بعد ذلك، قم بإجراء خمس دورات لذوبان الجليد عن طريق تخزين قارورة تعليق الدهون المرطب عند ناقص 80 درجة مئوية حتى يتم تجميدها. ومن ثم نقله إلى حمام مائي 35 درجة مئوية لإذابة تعليق الدهون. دوامة التعليق المذاب حتى متجانسة قبل الشروع في الدورة التالية.

قبل بدء التجربة، قم بتجميع إعداد البثق باستخدام غشاء متعدد الكربونات بين دعامتين للغشاء وإضافة فلترات ورق على كل جانب لتوفير دعم إضافي. استخدام المحاقن الزجاجية محكم لترطيب غشاء البولي عن طريق تمرير 0.3 ملليلتر من الماء الثقيل من خلال تجميع الغشاء عدة مرات. بعد ترطيب الغشاء، أدخل حقنة واحدة ضيقة بالغاز ملليلتر مع محلول دهون أبيض حليبي معد في نهاية واحدة وحقنة فارغة في الطرف الآخر من جهاز البثق.

بمجرد توصيل المحاقن، ضع التجميع في كتلة البثق. برمجة المضخة عن طريق الضغط باستمرار على زر معدل لدخول معدل البثق واضغط على زر القطر لدخول قطر الحقنة. ثم اضغط على سحب حتى يتم تشغيل الضوء.

اضغط على بدء وانتظر العينة لبدء الاستغناء في حقنة فارغة. اضغط على زر إيقاف قبل حقنة العينة فارغة تماما. سجل مستوى الصوت الذي تم توزيعه، ثم اضغط على زر Rate حتى تظهر المرحلة الأولى على الشاشة.

مع إيقاف تشغيل ضوء السحب، اضغط على زر مستوى الصوت لإدخال مستوى الصوت الذي تم توزيعه المسجل سابقا. اضغط على زر Rate مرة أخرى واستخدم السهم الأيمن الأكثر متابعة للوصول إلى المرحلة الثانية. اضغط على وحدة التخزين لإدخال نفس قيمة وحدة التخزين الموزعة المسجلة سابقا.

في هذه المرحلة، اضغط على زر السحب حتى يتم تشغيل ضوء السحب. كرر دورة المرحلة الثالثة بالضغط على زر الصوت حتى يظهر LP:SE على الشاشة وتعيينه إلى 20. وأخيرا، اضغط على زر Rate (معدل)، والوصول إلى المرحلة الرابعة، والضغط على زر مستوى الصوت للوصول إلى وظيفة Stop لإنهاء إعداد المضخة.

بعد برمجة المضخة، اضغط على البدء لبدء دورة البثق. قم بإجراء 15 إلى 20 دورة قذف قبل جمع تعليق الدهون الأزرق الشفاف المقذوف من العقيق في قارورة نظيفة للقياسات. افتح برنامج DAVE وحدد تقليل بيانات NSE من قائمة "تقليل البيانات".

تحميل ملفات البيانات عبر قيم Q مختلفة باستخدام فتح echo Files من قائمة الملفات. ستظهر الملفات التي تم تحميلها ضمن مجموعات البيانات المتوفرة. انقر بزر الماوس الأيمن على الملف المحدد وتسميته وفقا للقياس الذي يتوافق مع نموذج أو خلية أو دقة.

باستخدام علامة التبويب مجموعة البيانات، قم بتجميع وحدات بكسل الكاشف في 2 X 2 لتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء. تطبيق binning نفس إلى كافة ملفات الدقة الخلية و نموذج. فحص البيانات على جميع مجموعات بكسل وإخفاء تلك مع إشارات الفقراء عن طريق الضغط على مفتاح النهاية على لوحة المفاتيح.

اضغط على Enter للوصول إلى نافذة منبثقة لتطبيق القناع نفسه على جميع الأوقات الأربعة. سوف بكسل ملثمين تتحول إلى اللون الأخضر. تأكد من أن البيانات التي تم جمعها في شكل إشارة صدى.

بدء تركيب ملف القرار من قائمة الملفات التي تم تحميلها عن طريق النقر بزر الماوس الأيمن على الملف المطلوب وتحديد صالح العمليات، Fit Echoes القرار من القائمة المنبثقة. تأكد من أن نوبات إشارات الصدى تسفر عن معلمات مناسبة معقولة. لفحص الخطأ المقترن بكل معلمة مناسبة عبر الكاشف بالكامل، حدد خيارات الصورة، ثم حدد المعلمة المناسبة ذات الاهتمام.

ثم انقر بزر الماوس الأيمن على صورة الكاشف للوصول إلى نافذة منبثقة تعرض خريطة شريط الأخطاء. إذا كان الاحتواء على بكسل معين غير مرض، فقم بإعادة ملاءمة الإشارة عبر هذا البكسل عن طريق تحديده، والضغط على علامة التبويب المناسب، ثم الضغط على Fit Pixel. إدخال معلمات بدء جديدة للمرحلة والفترة في علامة التبويب "ملائم".

تقليل ملف العينة عن طريق تحديد الملف المطابق من قائمة الملفات التي تم تحميلها وتسميتها. فحص جميع بكسل وقناع الفقراء على النحو المبين أعلاه. ثم انقر بزر الماوس الأيمن على الملف وحدد عمليات احتواء، استيراد مراحل.

بالنسبة لملف الدقة، تناسب إشارات الصدى كما هو موضح من قبل مع قيم الفترة دون تغيير ونقطة مرحلة الصدى المستوردة من الدقة تناسبها. أدخل مركز الحزمة لكافة ملفات البيانات عن طريق الوصول إلى علامة التبويب عام وإدخال قيم مركز الحزم X و Y المسجلة من التجربة. بمجرد اكتمال الإعدادات، احسب وظيفة التشتت المتوسطة التي تم تسويتها بالنقر بزر الماوس الأيمن على ملف العينة المطلوب من قائمة الملفات المجهزة وتحديد حساب I من Q من القائمة المنبثقة.

أدخل المعلومات المطلوبة لملفات الدقة والخلايا وعدد Q-arcs في النافذة المنبثقة، ثم اضغط موافق لعرض النتائج. لاحظ أن البيانات في سماوي يظهر إشارة رديئة بسبب آثار حافة كاشف وينبغي القضاء عليها عند تجميع مجموعات مختلفة من البيانات Q. وأخيرا، حفظ مجموعات البيانات المنخفضة كملفات ASCII وحفظ جلسة العمل بأكملها كمشروع DAVE في المجلد المطلوب.

في هذه الدراسة، تم إجراء قياسات NSE للعينات الدهنية التي أعدت مع مخططات الديوتريشن المختلفة. يتم إجراء قياسات NSE لتقلبات الانحناء الغشاء على الليبوسومات المتناقضة تماما. ينتج عن مخطط الديوتر هذا فرق كبير في الطول المتناثر بين جوهر الغشاء وبيئة السوائل المذابة ، مما يعزز بشكل كبير إشارة التشتت من الأغشية الدهنية ويحسن إحصاءات قياس ديناميكيات الانحناء.

من ناحية أخرى، تظهر قياسات NSE لتقلبات سماكة الأغشية من الليبوسومات انحرافات بالنسبة إلى Q إلى الاعتماد الثالث لتقلبات الانحناء. لعزل إشارة تقلبات السمك ، يتم تقسيم الإشارة التي تم الحصول عليها من قبل Q إلى الثالث ويتم تركيب الديناميكيات الزائدة على وظيفة Lorentzian في Q.This تعتمد على بيانات ذات نوعية جيدة ، والتي هي أكثر قابلية للتحقيق مع عينات من تركيزات عالية وإشارات تشتيت قوية. يمكن استكشاف الديناميكيات التي بحثتها NSE بشكل تآزري من خلال قياس استرخاء الديوتريوم NMR والمحاكاة الديناميكية الجزيئية لتوضيح كيفية تأثير هياكل الدهون الجزيئية وزخارف التعبئة على وظائف الغشاء.

تلقي دراسات NSE على أغشية الدهون ضوءا جديدا على الفيزياء الحيوية للأغشية ، والعلاقات المعقدة لهيكل الغشاء وديناميكياته ، وكيف تؤثر على وظائف الغشاء والتفاعلات بين الغشاء والبروتين.