اختبار الحساسية السريع لمضادات الميكروبات عن طريق التصوير المحفز لنثر رامان لدمج الديوتيريوم في بكتيريا واحدة

يمكن الحصول على اختبار الحساسية السريع لمضادات الميكروبات في غضون 2.5 ساعة في البول والدم ، والذي يعتبر انخفاضا هائلا في وقت التحليل مقارنة بطريقة التخفيف الدقيق للمرق التقليدية. يمكنه مراقبة النشاط الأيضي البكتيري في بيئة معقدة ، مثل الدم الكامل. للبدء ، تحقق من تركيز البكتيريا من العينات عن طريق قياس الكثافة البصرية باستخدام مقياس ضوئي بطول موجة 600 نانومتر.

للوصول إلى تركيز الخلية النهائي من ثمانية في 10 إلى وحدات تشكيل المستعمرة الخامسة ، أو CFU ، لكل ملليلتر ، قم بتخفيف المحلول البكتيري باستخدام وسط MHB العادي بدون الديوتيريوم. بعد خلط الخلايا البكتيرية عن طريق الدوامة ، قم بإزالة 300 ميكرولتر من المحلول البكتيري في سبعة أنابيب دقيقة سعة 1.5 ملليلتر وقسمة 600 ميكرولتر من المحلول البكتيري في أنبوب صغير واحد سعة 1.5 ملليلتر. ثم أضف 4.8 ميكرولتر من محلول مخزون المضادات الحيوية إلى الأنبوب الدقيق الذي يحتوي على 600 ميكرولتر من المحلول البكتيري لتحقيق التركيز النهائي للمضاد الحيوي البالغ ثمانية ميكروجرام لكل ملليلتر.

أضف 300 ميكرولتر من المحلول البكتيري مع مضاد حيوي إلى 300 ميكرولتر من المحلول البكتيري بدون مضاد حيوي للحصول على محلول مخفف مزدوج مع تركيز نهائي للمضاد الحيوي يبلغ أربعة ميكروغرام لكل ملليلتر. كرر التخفيف التسلسلي المزدوج للمضادات الحيوية للاختبار حتى يتم الوصول إلى أدنى تركيز قدره 0.25 ميكروغرام لكل ملليلتر. تخلص من 300 ميكرولتر من المحلول من الأنبوب الصغير الأخير.

خصص أنبوبا واحدا بدون مضادات حيوية للتحكم الإيجابي مع علاج الديوتيريوم ، والتحكم السلبي بدون الديوتيريوم. احتضان القسمة البكتيرية مع المضاد الحيوي الذي يحتوي على وسط MHB لمدة ساعة واحدة. وفي الوقت نفسه ، قم بإعداد تخفيف تسلسلي للمضادات الحيوية بنسبة 100٪ ديوتيريوم يحتوي على وسط MHB بنفس تدرجات التركيز كما هو موضح من قبل.

بعد ساعة واحدة من الحضانة ، أضف 700 ميكرولتر من المضادات الحيوية المخففة بشكل متسلسل مع 100٪ ديوتيريوم يحتوي على وسط MHB إلى 300 ميكرولتر من البكتيريا المعالجة مسبقا بالمضادات الحيوية بنفس تركيز المضادات الحيوية. تجانس الخليط عن طريق سحب لأعلى ولأسفل عدة مرات. أضف 700 ميكرولتر من الديوتيريوم الخالي من المضادات الحيوية بنسبة 100٪ والذي يحتوي على وسط MHB إلى 300 ميكرولتر من البكتيريا الخالية من المضادات الحيوية كعنصر تحكم إيجابي.

أضف 700 ميكرولتر من الديوتيريوم 0٪ الخالي من المضادات الحيوية الذي يحتوي على متوسط MHB إلى 300 ميكرولتر من البكتيريا الخالية من المضادات الحيوية كعنصر تحكم سلبي. احتضان جميع الأنابيب الدقيقة عند 37 درجة مئوية و 200 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة. بعد الحضانة ، جهاز طرد مركزي ملليلتر واحد من المضادات الحيوية والديوتيريوم تعامل عينة بكتيرية في 6،200 مرة ز لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية.

ثم اغسل الحبيبات مرتين بالماء النقي. ثبت العينات في محلول فورمالين بحجم 10٪ ، وقم بتخزينها عند أربع درجات مئوية. تحقق من تركيز الإشريكية القولونية من العينة البكتيرية المعدة حديثا عن طريق قياس الكثافة البصرية باستخدام مقياس ضوئي بطول موجة 600 نانومتر.

لتقليد عينات عدوى المسالك البولية السريرية ، قم برفع عينة الإشريكية القولونية إلى 10 ملليلتر من عينات البول غير المحددة للوصول إلى تركيز نهائي من 10 إلى ستة CFU لكل ملليلتر. قم بتصفية البول المسنن الإشريكية القولونية باستخدام مرشح خمسة ميكرون ، وقسم المحلول البكتيري المصفى في 300 قلمة ميكرولتر إلى سبعة أنابيب دقيقة سعة 1.5 ملليلتر ، وقسمة 600 ميكرولتر في أنبوب صغير واحد سعة 1.5 ملليلتر. إجراء علاج دمج الديوتيريوم في وجود المضادات الحيوية كما هو موضح من قبل.

لتقليد عينات عدوى مجرى الدم السريرية ، قم بارتفاع Pseudomonas aeruginosa في ملليلتر واحد من دم الإنسان غير المحدد للوصول إلى تركيز نهائي من 10 إلى CFU السادس لكل ملليلتر. لتحليل الدم ، أضف تسعة ملليلتر من الماء النقي المعقم. قم بتصفية الدم الزائف الزنجاري باستخدام مرشح خمسة ميكرون.

ثم حصاد البكتيريا من العينة المفلترة إلى حجم ملليلتر واحد عن طريق الطرد المركزي في 6،200 مرة ز لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. بعد الطرد المركزي ، قسم محلول الدم Pseudomonas aeruginosa في 300 قلمة ميكرولتر إلى سبعة أنابيب دقيقة سعة 1.5 ملليلتر وقسمة 600 ميكرولتر من المحلول البكتيري في أنبوب دقيق واحد سعة 1.5 ملليلتر ، وقم بإجراء علاج دمج الديوتيريوم في وجود المضادات الحيوية كما هو موضح من قبل. لإعداد العينة ، اغسل ملليلتر واحد من محلول البكتيريا الثابتة بالماء النقي ، وطرد محلول البكتيريا المغسول في 6،200 مرة جم لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية.

إزالة الطافي وإثراء المحلول البكتيري إلى حوالي 20 ميكرولتر بالماء المعقم. قم بإيداع المحلول البكتيري على زجاج غطاء مطلي ب poly-L-lysine ، وساندويتش بغطاء زجاجي آخر ، وختم العينة. في مجهر SRS ، يوفر ليزر الفيمتو ثانية القابل للضبط بمعدل تكرار 80 ميجاهرتز المضخة وليزر الإثارة Stokes.

يتم تعديل شعاع ستوكس بواسطة المغير الصوتي البصري عند 2.4 ميغا هرتز. يتم دمج الحزمتين بشكل جماعي من خلال مرآة ثنائية اللون. ثم يتم توجيه المضخة وأشعة ستوكس إلى مجهر المسح الضوئي بالليزر المصمم في المختبر مع مرآة 2D Galvo للمسح بالليزر.

يركز هدف الماء 60x الليزر على العينة ويجمع مكثف الزيت الإشارة من العينة. يتم استخدام مرشحين لتصفية شعاع Stokes ، بينما يتم اكتشاف شعاع المضخة بواسطة الصمام الثنائي الضوئي ، وبعد ذلك يتم استخراج إشارة Raman المحفزة بواسطة مكبر صوت قفل. باستخدام برنامج التحكم ، أدخل وضبط الطول الموجي للمضخة إلى 852 نانومتر.

اضبط التردد الاهتزازي C إلى D على رقم موجة 2،168 لتصوير البكتيريا باستخدام مجهر SRS. قم بقياس طاقة الليزر باستخدام مقياس الطاقة. اضبط قوة ليزر المضخة في العينة على ثمانية ملي واط ، وقوة ليزر ستوكس عند العينة على 50 ملي واط عن طريق ضبط لوحة نصف الموجة أمام خرج الليزر.

ضع العينة القياسية DMSO d6 في مرحلة العينة ، واستخدم هدف الغمر في الماء 60x لتركيز المضخة وليزر Stokes على العينة. من خلال ضبط مسامير المرايا العاكسة ، قم بمحاذاة المضخة وحزم ستوكس مكانيا وتوجيه الحزمتين إلى مجهر عمودي مجهز بنظام مرآة 2D Galvo للمسح بالليزر. في لوحة تحكم البرنامج ، اضبط كل صورة SRS لتحتوي على 200 × 200 بكسل ووقت بقاء البكسل على 30 ميكروثانية.

يبلغ إجمالي وقت الحصول على صورة واحدة حوالي 1.2 ثانية. اضبط حجم الخطوة على 150 نانومتر ، بحيث يكون حجم الصورة حوالي 30 × 30 ميكرومتر مربع. بعد تحسين النظام ، أخرج العينة القياسية ، وضع العينة البكتيرية في مرحلة العينة تحت هدف الغمر في الماء 60x.

ابدأ تصوير SRS للعينات البكتيرية. قم بتصوير ثلاثة حقول عرض على الأقل لكل عينة. يتم قياس تأثير وقت الحضانة على دمج الديوتيريوم بواسطة التحليل الطيفي الدقيق لرامان التلقائي في منطقتي CD و CH.

أظهر مخطط نسبة كثافة CD إلى CH على وقت حضانة الديوتيريوم للبكتيريا المفردة زيادة في كثافة CD على CH خلال وقت الحضانة من صفر إلى 180 دقيقة. تم إجراء تصوير SRS لل Pseudomonas aeruginosa عند الحضانة مع الجنتاميسين و 70٪ الديوتيريوم. أظهر التحليل الإحصائي الكمي الإضافي أن إشارات CD للبكتيريا كانت أقل بكثير عند ميكروغرام لكل ملليلتر ، أو تركيز جنتاميسين أعلى من دون علاج الجنتاميسين.

خلصت عتبة شدة القطع عند 0.60 إلى أن Pseudomonas aeruginosa تم تثبيطه أيضيا عند ميكروغرام لكل مليلتر وتركيزات أعلى من الجنتاميسين. تم تحديد SC-MIC لل Pseudomonas aeruginosa ضد الجنتاميسين في وسط MHB الطبيعي على أنه ميكروجرامان لكل مليلتر ، والذي كان ضمن نطاق الفرق بمقدار أضعاف واحد مع MIC البالغ أربعة ميكروغرام لكل ملليلتر والذي تم تحديده بواسطة طريقة التخفيف الدقيق للمرق. تم إجراء اختبار الحساسية السريع لمضادات الميكروبات ، أو AST ، لعينات البول المسننة بالإشريكية القولونية بواسطة تصوير SRS.

تم تحديد SC-MIC لعينة البول المسننة للإشريكية القولونية ضد الأموكسيسيلين على أنها أربعة ميكروغرام لكل مليلتر ، والتي لها نفس قراءات الحساسية مثل MIC البالغة ثمانية ميكروغرام لكل مليلتر بواسطة طريقة تخفيف المرق التقليدية للإشريكية القولونية النقية في وسط MHB العادي. تم التحقيق في قابلية تطبيق AST السريع لل Pseudomonas aeruginosa المتصاعد في دم الإنسان بواسطة تصوير SRS. سيطرت على كثافة القرص المضغوط لصورة SRS عند 2،168 في المائة إشارات بكتيرية ناشئة عن دمج الديوتيريوم الأيضي للبكتيريا الحية.

تم تحديد SC-MIC لل Pseudomonas aeruginosa في الدم على أنه ميكروجرامان لكل مليلتر ، وهو ما يتفق جيدا مع نتيجة MIC القياسية التقليدية ل Pseudomonas aeruginosa في وسط النمو الطبيعي. يتم الاحتفاظ برقم الخلية البكتيرية المستخدمة في اختبار الحساسية لمضادات الميكروبات عند حوالي خمسة أضعاف 10 إلى وحدات تشكيل المستعمرة الخامسة لكل ملليلتر ، على النحو الموصى به من قبل معهد المعايير السريرية والمخبرية. يمكن أن يؤدي ارتفاع تركيز البكتيريا إلى زيادة في الحد الأدنى من التركيز المثبط.

يمكن أن يكون الجمع بين تحديد مسببات الأمراض في الموقع والتشخيص السريع لاختبار الحساسية لمضادات الميكروبات ذا إمكانات كبيرة للترجمة إلى عيادة تسمح بتحديد العوامل المضادة للميكروبات المناسبة في الوقت المناسب للعلاج الدقيق.