تحليل على نطاق الجينوم لتوزيع تعديلات الهستون باستخدام طريقة تسلسل المناعة الكروماتين في ماغنابورتي أوريزاي

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في توضيح الآليات الجزيئية الكامنة وراء تنظيم الجينات المستهدفة المرشحة عن طريق التعديلات اللاجينية أثناء مسببات الأمراض الفطرية في علم الأمراض النباتية. يمكن لتكنولوجيا تسلسل المناعة الكروماتين الكشف بكفاءة عن شرائح الحمض النووي التي تتفاعل مع الهستونات وعوامل النسخ في الجينوم بأكمله. بالمقارنة مع غيرها من الأساليب، فإنه يمكن تحسين الكفاءة والقرار.

تبدأ بإضافة 100 ميكرولتر من السائل المتوسط الكامل إلى لوحات طماطم الشوفان Agger باستخدام ماصة 100 ميكرولتر. باستخدام حلقة التطعيم، كشط mycelia من سلالة نوع البرية وسلالة خروج المغلوب. جمع الحطام mycelia ونقلها إلى 250 ملليلتر من السائل المتوسط كاملة.

غسل الهيفا الفطرية مع 500 ملليلتر من محلول كلوريد الصوديوم المولر 0.7. ثم جمع myceliUM الفطرية ووزنها. إضافة ما يقرب من ملليلتر واحد من محلول تتغلغل إنزيم التحلل لكل غرام واحد من الميسيليوم الفطري.

ضع الهيفاي للقطع عند 28 درجة مئوية لمدة ثلاث إلى أربع ساعات مع الاهتزاز عند 150 دورة في الدقيقة. اغسل الهيفا القملية ب 50 ملليلتر من محلول كلوريد الصوديوم المولاري 0.7. طرد مركزي العينة والتخلص من supernatant بعناية.

إعادة تعليق بروتوبلاست في 20 ملليلتر من محلول كلوريد الصوديوم الضرس 0.7. إضافة 55 ميكرولتر من 37٪ انخفاض الفورمالديهايد عن طريق الانخفاض إلى اثنين من ملليلتر من كلوريد الصوديوم العازلة التي تحتوي على protoplasts لربط عبر حتى التركيز النهائي هو 1٪ لإرواء الفورمالديهايد غير المنقحة، إضافة 20 ميكرولتر من 10 مرات الجليسين إلى كل أنبوب. تجاهل supernatant بعناية بعد الطرد المركزي.

إعادة تعليق بيليه في ملليلتر واحد من محلول كلوريد الصوديوم الضرس 0.7. تجاهل supernatant بعناية بعد الطرد المركزي وإعادة تعليق بيليه في 750 ميكرولتر من العازلة RIPA. إضافة 37.5 ميكرولتر من 20 مرة مثبط البروتيز.

القص الكروماتين عن طريق سونيكيشن لمدة ثماني دقائق باستخدام متجانس بالموجات فوق الصوتية. بعد أن تم كسر العينة بالموجات فوق الصوتية ، أخرج جزءا من العينة كمدخلات تحتوي على جميع الحمض النووي والبروتين الذي تم إطلاقه بعد سونيكاتيد العينة. لتحليل طول شظايا الحمض النووي، قم بتشغيل 1٪ agarose هلام الكهربائي بعد سونيكيشن.

بعد الطرد المركزي، قم بنقل الناطور الفائق الطرد المركزي إلى أنبوب طرد مركزي 1.5 ملليلتر وتخزينه عند درجة حرارة سالبة 80 درجة مئوية لاستخدامه لاحقا. قبل إجراء تجربة IP، قم بتخفيف كل عينة كروماتين إلى نسبة من واحد إلى 10 مع حاجز RIPA مرة واحدة. ماصة 50 ميكرولتر من حبات البروتين شبه المغناطيسي السوبر في أنبوب الطرد المركزي ملليلتر اثنين.

ضع الأنابيب على حامل مغناطيسي ودع الخرز المغناطيسي يترسب. ثم إزالة supernatant. إضافة ملليلتر واحد من تبريدها مسبقا مرة واحدة RIPA العازلة إلى الأنبوب وغسل حبات البروتين شبه المغناطيسي السوبر ثلاث مرات.

ضع الأنابيب على حامل مغناطيسي وأزل الناسخة الفائقة. إضافة 100 ميكرولتر من واحد مرة RIPA العازلة إلى كل أنبوب. إضافة 30 ميكرولتر من عينة الكروماتين، 100 ميكرولتر من حبات البروتين شبه المغناطيسي السوبر وأربعة ميكرولترات من الأجسام المضادة H3K4me3 إلى الأنبوب، وخلطها بشكل جيد.

وضع العينات على شاكر دوار لاحتضان لهم بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية في 30 مرة G.Wash البروتين شبه المغناطيسي السوبر حبة الأجسام المضادة ومجمع الكروماتين عن طريق إعادة تعليق الخرز في ملليلتر واحد من واحد مرة ريبا العازلة. غسل العينة مع ملليلتر واحد من الملح المنخفض العازلة غسل مجمع المناعة، ثم مع ملليلتر واحد من الملح العالي العازلة غسل مجمع المناعة. شطف الخرز مع ملليلتر واحد من كلوريد الليثيوم العازلة وإزالة supernatant.

ثم أضف ملليلتر واحد من المخزن المؤقت TE إلى الأنبوب. ضع الأنبوب مرة أخرى مع ملليلتر واحد من العازلة TE وإزالة supernatant مع ماصة. إضافة 100 ميكرولتر من العازلة elution إلى كل أنبوب الطرد المركزي.

نفذ الغبطة عند 65 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. جهاز الطرد المركزي لمدة دقيقة واحدة في 10،000 مرة G في أربع درجات مئوية وجمع supernatant في أنابيب الطرد المركزي الجديدة. إضافة ثمانية ميكرولتر من خمسة كلوريد الصوديوم الضرس إلى جميع الأنابيب واحتضان في 65 درجة مئوية لمدة أربع إلى خمس ساعات أو بين عشية وضحاها لعكس بروتين الحمض النووي عبر الروابط.

إضافة ميكرولتر واحد من Rnase A واحتضان لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية. إضافة أربعة ميكرولترات من البروتين K إلى كل أنبوب واحتضان في 45 درجة مئوية لمدة ساعة إلى ساعتين. إضافة 550 ميكرولتر من الكلوروفورم الحلبي وخليط الكحول isoamyl إلى أنبوب الطرد المركزي.

الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في 10، 000 مرة G و يستنشق supernatant. إضافة 1/10 حجم ثلاثة محلول خلات الصوديوم الضرس، 2.5 مجلدات من الإيثانول المطلق وثلاثة ميكرولترات من الجليكوجين إلى الأنبوب. ضع العينة في ثلاجة عند درجة حرارة سالبة 20 درجة مئوية بين عشية وضحاها لهطول الأمطار.

في اليوم التالي، طرد مركزي الأنابيب والتخلص من supernatant. غسل بيليه ثلاث مرات مع ملليلتر واحد من الإيثانول الطازجة 75٪ في 10، 000 مرة G.Add 50 ميكرولتر من الماء المؤين العقيم لإذابة ما يكفي من المرسب. إصلاح ينتهي الحمض النووي لتوليد الحمض النووي حادة انتهت باستخدام مجموعة إصلاح نهاية الحمض النووي، والتعليمات المذكورة في المخطوطة النصية.

لإضافة أساس أدينين إلى النهايات الرئيسية الثلاثة ، أضف 30 ميكرولتر من الحمض النووي ، واثنين من ميكرولترات الماء ، وخمسة ميكرولترات من 10 أضعاف حاجز Taq ، و 10 ميكرولترات من dATP ملليمولار واحد وثلاثة ميكرولترات من بوليميراز الحمض النووي Taq إلى أنبوب طرد مركزي PCR 0.2 ميكرولتر. مزجها والتفاعل في جهاز PCR في 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. أداء ربط الرابط عن طريق خلط 10 ميكرولتر من الحمض النووي، 9.9 ميكرولتر من الماء، 2.5 ميكرولتر من T4 الحمض النووي ليغانز العازلة، 0.1 ميكرولتر من مزيج أوليغو محول، و 2.5 ميكرولتر من T4 الحمض النووي ليغانيس في أنبوب الطرد المركزي PCR 0.2 ميكرولتر.

احتضان الأنبوب في 16 درجة مئوية لمدة أربع ساعات. لتضخيم الحمض النووي باستخدام التمهيديات PCR، إضافة 10.5 ميكرولتر من الحمض النووي، 12.5 ميكرولتر من مزيج رئيسي عالي الدقة مرتين. ميكرولتر واحد من PCR التمهيدي PE 1.0 وميكرويلتر واحد من PCR التمهيدي PE 2.0 إلى أنبوب الطرد المركزي PCR 0.2 ميكرولتر وتخلط جيدا.

وانخفضت بشكل كبير في المناطق المستهدفة الوظيفية إشارات H3K4me3 من المسوخ حذف mobre2، mospp1 وmoswd2. بالمقارنة مع سلالة النوع البري P131 ، انخفضت إلى حد كبير إشارات تسلسل مناعة الكروماتين H3K4me3 المخصب في مسوخ حذف mobre2 و mospp1 و moswd2. بعد هذا الإجراء، يمكن إجراء رقاقة على رقاقة ورقاقة qPCR.

وهي تستخدم عموما لفحص الجين المستهدف المصب من البروتين ودراسة تفاعلات الحمض النووي البروتين في مواقع ربط الجينوم المعروفة.