تحليل تتبع الجسيمات النانوية لتحديد كمي وحجم الحويصلات خارج الخلية

نتائج NTA عرضة جدا لتحيز المشغل. يوضح هذا البروتوكول تأثيرات معلمات NTA المعدلة على النتائج التي تم الحصول عليها. وهناك طريقة موحدة تساعد على زيادة الصرامة والتكرار في تحليل NTA.

تحليل العينة في cuvette يسمح لعينة عشوائية إحصائيا ليتم التقاطها في كل فيديو. وهذا يؤدي إلى بيانات أكثر قابلية للاستنساخ وتصور الجسيمات على مدى مجموعة واسعة من الأحجام. كما الحصول على عينة في نطاق تركيز الجسيمات الموصى بها يمكن أن يكون صعبا، تأكد من إجراء تخفيف المسلسل لتحديد عامل التخفيف المثالي.

إثبات الإجراء سيكون كونغهنغ كاي، طالب دكتوراه من مختبر أنتوني فيرانتي. لإعداد cuvette لتحليل تتبع الجسيمات النانوية ، قم بتغطية مساحة العمل بمادة خالية من الوبر لمنع الألياف من دخول cuvettes. ارتداء قفازات، ووضع cuvette تحتوي على شريط ضجة على الرقصة cuvette المغناطيسي.

استخدام أداة هوك لوضع إدراج في cuvette مع درجة إدراج مرئية في الجزء الأمامي من cuvette. استخدام ماصة لإضافة ببطء 400 إلى 500 ميكرولتر من الحويصلات خارج الخلية المنقى على cuvette من خلال ثقب في إدراج وخلط العينة عن طريق الأنابيب بلطف دون إدخال فقاعات الهواء، ثم سقف cuvette، والتنصت على فقاعات حسب الضرورة واستخدام قطعة قماش خالية من الوبر لمسح السطح الخارجي للكوفيت. لتحليل تركيز الجسيمات من المعادن أو عينة، بدوره على محطة عمل الكمبيوتر وأداة وبدء برنامج تحليل تتبع الجسيمات.

عند مطالبتك، انقر فوق NTA ثم افتح علامة التبويب التسجيل. اتبع الإرشادات التي تظهر على الشاشة لملء جميع المعلومات اللازمة للعينة. لتحليل تتبع EV، تعيين الذوبان إلى برنامج تلفزيوني.

الملوحة سوف لصناعة السيارات في ملء إلى 9٪ للحصول على تركيز الجسيمات الذوبان أو عينة، وفتح غطاء الصك وإزالة غطاء واقية حيث سيتم وضع cuvette. تحميل cuvette في الصك في الاتجاه الصحيح مع درجة من إدراج تواجه الكاميرا واستبدال غطاء وغطاء الصك. انقر فوق سهم الدفق لتشغيل الكاميرا وانقر فوق سهم شيفرون لتوسيع إعدادات السجل.

ضبط التركيز حتى الجسيمات الصغيرة نسبيا مرئية بوضوح. لتعيين التحليل لتحديد كم EV صغير، قم بتعيين معدل الإطار إلى 30 إطارا في الثانية، والتعرض ل 15 مللي ثانية، ووقت التقليب إلى خمس ثوان، ووقت الانتظار إلى ثلاث ثوان، وقوى الليزر الزرقاء والخضراء والحمراء إلى 210 و12 و8 ملليواط على التوالي، والإطارات لكل فيديو إلى 300، والمكاسب إلى 30 ديسيبل. ضبط التركيز حتى الجسيمات الصغيرة نسبيا مرئية بوضوح.

زيادة التكبير و / أو الكسب يمكن أن تساعد مع تركيز الجسيمات. ولكن إذا قمت بزيادة المكاسب، تذكر لتعيينه إلى 30 ديسيبل قبل التسجيل. بمجرد تركيز الجسيمات، قم بتعيين إعداد التكبير/التصغير إلى 0.5X لحفظ عرض النطاق الترددي ومنع فقدان الإطارات والنقر فوق السجل لبدء تسجيل الفيديو.

عندما تظهر مطالبة تفيد بأنه تم تسجيل مقاطع الفيديو، انقر فوق موافق لإكمال التسجيل وحدد علامة التبويب العملية. إذا كانت الجسيمات الكبيرة جدا مرئية في أي فيديو أثناء التسجيل ، فانتقل إلى دليل مقاطع الفيديو المسجلة وأزل أي فيديو إشكالي قبل المعالجة. تحقق من مربع تجاوز الكشف عن الصوت تعطيل وتعيين قطر الميزة إلى 30.

انقر فوق عملية لبدء معالجة الفيديو وعرض رسم بياني للتوزيع المباشر. عند اكتمال المعالجة، انقر فوق موافق وحدد علامة التبويب رسم. بالنسبة إلى المركبات الكهربائية، اعرض المخطط الرئيسي كسجل بن سيليكا.

يمكن تخصيص ميزات أخرى من الرسم البياني، مثل تغيير المحور س لتعيين منطقة لدمج الشكل المنتج. لإنشاء تقرير PDF للنتائج، انقر فوق الزر التقرير. سيتم عرض المتوسط والمتوسط وحجم الوضع والتركيز المعدل لعامل التخفيف وعرض التوزيع.

يجب إجراء NTA من الذوبان قبل أي عينة بحيث يمكن طرح تركيز هذا الفراغ من تركيز الجسيمات عينة EV. لتنظيف cuvettes بعد التحليل، إفراغ cuvette وملء تماما cuvettes 10 إلى 15 مرات مع الماء deionized وثلاث مرات مع 70 إلى 100٪ الإيثانول لإزالة أي عينة المتبقية. جفف الجزء الخارجي من اللحاف بقطعة قماش خالية من الوبر وجفف الداخل بمغبرة هواء مضغوطة.

لتنظيف الإدراجات وتقليب القضبان، ضع المواد في قارورة زجاج متألقة تحتوي على الإيثانول بنسبة 70 إلى 100٪، وهز القارورة بقوة. ثم شطف إدراج واثارة القضبان في الماء deionized مع اهتزاز كما هو موضح وتجفيفها باستخدام الملابس الخالية من الوبر. بعد التجفيف، ضع على الفور جميع المكونات النظيفة في التخزين حتى التحليل التالي.

قبل إجراء تحليل، تم اختبار معايرة الأداة باستخدام حبات البوليسترين لضمان صحة البيانات المكتسبة. وكما لوحظ، أبلغت أداة تتبع الجسيمات بدقة عن حجم حبات المنوديسبيرز التي يبلغ عددها 100 نانومتر، ولكنها لم تبلغ إلا عن كثب عن حجم حبات النانومتر التي يبلغ عددها 400 حبة. لذلك، كانت إعدادات الجهاز لهذا البروتوكول أكثر دقة للجسيمات الصغيرة، أقرب إلى 100 نانومتر في الحجم.

باستخدام هذه الإعدادات، ذكرت جداول تركيز الجسيمات وفقا لذلك مع عامل التخفيف مما يدل على أن الصك يمكن الكشف بدقة تركيز الجسيمات في تخفيفات مختلفة مع القليل من التباين بين replicants التقنية. تم تحديد التخفيف الأمثل لعينة EV المشتقة من أنسجة الماوس 4.41 مرة 10 إلى 10 لكل عينة EV المشتقة من أنسجة الماوس بالملليلتر بين 1 و 000 و 3000. في هذا التحليل، وزيادة كسب زيادة حساسية الكاميرا، مما يسمح بزيادة في التصور لعدد أكبر من الجسيمات الصغيرة.

زيادة قوة الليزر الزرقاء من 70 إلى 210 ملليواط مع الحفاظ على قوى الليزر الخضراء والحمراء ثابتة حولت متوسط حجم الجسيمات المبلغ عنها من 122 إلى 105 نانومتر وزيادة تركيز الجسيمات الإجمالي المبلغ عنه من 1.1 مرة 10 إلى الثامن إلى 1.7 مرة 10 إلى الثامن. زيادة قوة الليزر الأحمر زيادة متوسط حجم الجسيمات المبلغ عنها من 175 إلى 246 نانومتر وانخفاض تركيز الجسيمات الإجمالي المبلغ عنها. أدت زيادة طاقة الليزر الخضراء إلى انخفاض في متوسط حجم الجسيمات المبلغ عنه وزيادة في تركيز الجسيمات الإجمالي المبلغ عنه.

العثور على التخفيف الصحيح لوضع عينة ضمن نطاق الكشف الأمثل يمكن أن يستغرق بضع محاولات لكل عينة. تنظيف cuvette يتطلب أيضا التعامل معها بعناية إضافية. نوصي بتطبيق أكثر من طريقة متعامدة واحدة لقياس حجم الجسيمات EV وتركيزها.

كما يمكن إجراء تشتت الضوء الديناميكي، واستشعار النبض المقاوم، والمجهر الإلكتروني الإرسالي، واستشعار التصوير الانعكاسي التداخلي أحادي الجسيمات لتوصيف المركبات الكهربائية.