في سيتو استكشاف مورين ميغاكاريوبويز باستخدام المجهر الإلكتروني انتقال

الهدف العام لهذا الإجراء هو مراقبة البنية الفائقة للخلايا العملاقة الموجودة داخل نخاع عظم الفأر ، وتحديد مراحل النضج المختلفة باستخدام المجهر الإلكتروني عالي الدقة. الميزة الرئيسية هي الفحص المباشر للخلايا العملاقة في البيئة الأصلية ، والتي تختلف عن الخلايا العملاقة المستزرعة في المختبر التي كما نعلم لا تصل إلى المستوى الكامل للنضج. بعد حصاد الساق وعظم الفخذ من 12 إلى 18 أسبوعا C57BL/6 الفئران وفقا للبروتوكولات القياسية، واستخدام شفرة حلاقة حادة لإزالة epiphyses من كل العظام.

عقد كل العظام مع ملاقط، إدراج إبرة قياس 21 تعلق على حقنة خمسة ملليلتر مليئة العازلة cacodylate في نهاية واحدة من العظام وتدفق نخاع العظام في أنبوب جمع 15 ملليلتر تحتوي على اثنين من ملليلتر من العازلة cacodylate الطازجة. مباشرة بعد التنظيف، استخدم ماصة بلاستيكية لنقل اسطوانات نخاع العظم إلى ملليلتر واحد من محلول تثبيت الغلوتارالدهيد الطازج لاحتضان لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. لتضمين نخاع العظم في الآغروز، اغسل العينات الثابتة في المخزن المؤقت الصبار الطازج واستخدم ماصة بلاستيكية لنقل نخاع العظم بعناية إلى شريحة زجاجية.

باستخدام ماصة دافئة، وتطبيق بسرعة قطرة من 2٪ أجار السائل إلى اسطوانات نخاع العظام، وعلى الفور وضع الشريحة على الجليد لمدة دقيقة إلى دقيقتين. عندما يتوطد أغار، استخدم مجهر ستيريو وشفرة حلاقة حادة لتجاهل أطراف كل أسطوانة نخاع عظمي ونقل كتل النخاع المشذبة إلى أنبوب طرد دقيق سعة 1.5 ملليلتر يحتوي على ملليلتر واحد من العازلة الصبارية. لتضمين الراتنج، إصلاح كتل مع 1٪ osmium tetroxide في العازلة cacodylate في غطاء محرك السيارة الكيميائية لمدة ساعة واحدة في أربع درجات مئوية قبل غسل كتل مرة واحدة مع العازلة cacodylate ومرة واحدة مع الماء المقطر.

بعد غسل الماء، وصمة عار الكتل مع خلات أورانيل 4٪ في الماء المقطر لمدة ساعة واحدة تليها اثنين من يغسل في الماء المقطر كما هو موضح. بعد الغسيل الأخير ، يجفف الكتل من خلال سلسلة تصاعدية من غمر الإيثانول والماء المقطر على النحو المشار إليه. للحصول على تسلل موحد وبلمرة من راتنج الايبوكسي داخل النخاع، واحتضان كتل في اثنين من الحمامات المتعاقبة من أكسيد البروبيلين لمدة 15 دقيقة قبل احتضان العينات في خليط واحد إلى واحد من أكسيد البروبيلين 100٪ وراتنج الايبوكسي لمدة ساعة واحدة على شاكر دوارة بطيئة في درجة حرارة الغرفة.

في نهاية الحضانة، أضف راتنج الايبوكسي بنسبة 100٪ إلى كتل النخاع لاحتضانه بين عشية وضحاها في نفس الظروف، ثم أضف راتنج الايبوكسي بنسبة 100٪ لاحتضان آخر لمدة ساعتين. في نهاية الحضانة، استخدم المجهر لتوجيه كتل النخاع في قوالب السيليكون المسطحة للسماح بقسمها العرضي اللاحق وملء القوالب راتنج الايبوكسي قبل وضعها عند 60 درجة مئوية لمدة 48 ساعة. بالنسبة للقسم الرقيق جدا، قم بتركيب كتلة العينة على دعم microtome فائقة و تركيب الدعم على حامل العينة.

استخدم قاطع طحن الماس لتقليم العينات بزاوية 45 درجة لإزالة الراتنج الزائد حول الأنسجة قبل استخدام شفرة سكين ماسية مجهزة بخزان مياه لقطع المقاطع العرضية السميكة 500 و 100 نانومتر للتحليل النسيجي وTEM على التوالي ، ثم استخدم حلقة لنقل الأجزاء السميكة 500 نانومتر العائمة على سطح الماء على شريحة زجاجية وإيداع 100 نانومتر سميكة أقسام على 200 شبكة رقيقة شريط شبكات النحاس مع مرشح ورقة تحتها. لتلطيخ الأزرق toluidine، بعد رسم أقسام سميكة 500 نانومتر على لوحة ساخنة 60 درجة، إضافة تصفية 1٪ toluidine الأزرق في الماء المقطر إلى أقسام لاحتضان لمدة دقيقة إلى دقيقتين. في نهاية الحضانة، اغسل العينات بالماء المقطر.

عندما تكون الشرائح قد جفت، استخدم تركيب المتوسطة لتركيب العينات مع coverlip وعرض العينات عن طريق المجهر الخفيفة. لتلطيخ التباين، قم بتسمية أقسام 100 نانومتر مع خلات أورانيل 4٪ لمدة خمس دقائق تليها ثلاث يغسل لمدة خمس دقائق بالماء المقطر. بعد الغسيل الأخير، قم بتلطيخ الأقسام بسيترات الرصاص لمدة ثلاث دقائق، تليها ثلاث غسلات لمدة خمس دقائق في الماء المقطر كما هو موضح.

بعد الغسيل الأخير، ضع الجانب السفلي من كل شبكة على اتصال بقطعة من ورق الفلتر أولا للسماح بوضع الشبكات على ورق التصفية لتجف. لفحص المقاطع بواسطة TEM ، عندما تجف الشبكات ، حدد تكبيرا منخفضا لتقييم الجودة العامة للاستعدادات. لتحديد عدد الخلايا الضخمة من كل مرحلة من مراحل النضج في كل قسم عرضي، حدد تكبيرا أعلى وحدد عدد الخلايا الضخمة للمرحلة الأولى أو الثانية أو الثالثة فقط في المربعات التي تغطيها الأنسجة بالكامل.

في هذا التحليل النسيجي التمثيلي ، يمكن ملاحظة استمرارية الأوعية الدقيقة وحجم وشكل الخلايا الضخمة بوضوح. وتنقسم الخلايا العملاقة مورين إلى أربع مراحل من النضج. المرحلة الأولى من الخلايا العملاقة لها نواة كبيرة.

كما أن وجود المرحلة الأولى القابلة للكشف من نظام غشاء الترسيم هو معيار رئيسي لهذه المرحلة. وفي المرحلة الثانية، يبدأ تكوين الحبيبات ويبدأ تطوير نظام غشاء الترسيم. المرحلة الثالثة megakaryocytes هي خلايا عملاقة مع أنظمة غشاء ترسيم متطورة، والأراضي السيتوبلازمية محددة بوضوح والمناطق الطرفية خالية من العضيات، والنوى الموجودة بشكل غريب الأطوار.

تتميز مرحلة الخلايا النارية من نضوج الخلايا العملاقة بنوة عارية. كما هو موضح، لوحظت الخلايا الضخمة في كثير من الأحيان في اتصال مع الخلايا البطانية. في بعض الأحيان ، تشكل الخلايا الضخمة نتوءات غازية قصيرة تخترق البطانة أو أنها تمتد البروبليتات إلى التجويف الجيوب الأنفية.

TEM يسمح أيضا تصور التفاصيل الهيكلية فائقة، فضلا عن وجود خلايا الدم التي اجتاحتها الخلايا الضخمة. يجب إجراء مسح نخاع العظم بعناية وفور تشريح العظام. لتحقيق أقصى قدر من سلامة الأنسجة، ويحيط النخاع مع هلام من أجار قبل الجفاف.

بعد هذا الإجراء، يمكن تصوير كتل نخاع العظم في تكبيرات مختلفة أو يمكن استخدامها لتحليل المجهر الإلكتروني ثلاثي الأبعاد الآخر، مثل المجهر الإلكتروني المركز للشعاع الأيوني.