Name: عزل السلف ميغاكاريوسيت الماوس (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: تعلم عزل السلف ميغاكاريوسيت من نخاع عظم الفئران باستخدام العرف الحرقفي لزيادة إنتاجية الخلايا. يتيح هذا البروتوكول الفعال إجراء تحليلات جزيئية ووظيفية دقيقة لفهم آليات تكوين الصفائح الدموية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ويود المؤلفون أن يشكروا مونيك فرويند وكاثرين زيسيل وكيتي على المساعدة التقنية. وقد دعم هذا العمل الرابطة العامة لمناهضة الانتخابات ومنظمة أطباء بلا حدود، وغرانت ANR-17-CE14-0001-01 إلى Henri.de la. سال.

<ol><li>Kaushansky, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Historical+review%3A+megakaryopoiesis+and+thrombopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Historical review: megakaryopoiesis and thrombopoiesis.</a> Blood. 111 (3), 981-986 (2008).</li>
<li>Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clonogenic+common+myeloid+progenitor+that+gives+rise+to+all+myeloid+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages.</a> Nature. 404 (6774), 193-197 (2000).</li>
<li>Debili, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+bipotent+erythro-megakaryocytic+progenitor+in+human+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Characterization of a bipotent erythro-megakaryocytic progenitor in human bone marrow.</a> Blood. 88 (4), 1284-1296 (1996).</li>
<li>Forsberg, E. C., Serwold, T., Kogan, S., Weissman, I. L., Passegué, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+evidence+supporting+megakaryocyte-erythrocyte+potential+of+flk2%2Fflt3%2B+multipotent+hematopoietic+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">New evidence supporting megakaryocyte-erythrocyte potential of flk2/flt3+ multipotent hematopoietic progenitors.</a> Cell. 126 (2), 415-426 (2006).</li>
<li>Vannucchi, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+a+bipotent+%28erythroid+and+megakaryocytic%29+cell+precursor+from+the+spleen+of+phenylhydrazine-treated+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of a bipotent (erythroid and megakaryocytic) cell precursor from the spleen of phenylhydrazine-treated mice.</a> Blood. 95 (8), 2559-2568 (2000).</li>
<li>Pronk, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidation+of+the+phenotypic%2C+functional%2C+and+molecular+topography+of+a+myeloerythroid+progenitor+cell+hierarchy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Elucidation of the phenotypic, functional, and molecular topography of a myeloerythroid progenitor cell hierarchy.</a> Cell Stem Cell. 1 (4), 428-442 (2007).</li>
<li>Nakorn, T. N., Miyamoto, T., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+mouse+clonogenic+megakaryocyte+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Characterization of mouse clonogenic megakaryocyte progenitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (1), 205-210 (2003).</li>
<li>Ng, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+thrombopoietin+%28TPO%29-responsive+progenitor+cells+in+adult+mouse+bone+marrow+with+in+vivo+megakaryocyte+and+erythroid+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Characterization of thrombopoietin (TPO)-responsive progenitor cells in adult mouse bone marrow with in vivo megakaryocyte and erythroid potential.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (7), 2364-2369 (2012).</li>
<li>Strassel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hirudin+and+heparin+enable+efficient+megakaryocyte+differentiation+of+mouse+bone+marrow+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Hirudin and heparin enable efficient megakaryocyte differentiation of mouse bone marrow progenitors.</a> Experimental Cell Research. 318 (1), 25-32 (2012).</li>
<li>Brouard, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unique+microenvironment+in+the+developing+liver+supports+the+expansion+of+megakaryocyte+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Advances%22%5BJournal%5D)">A unique microenvironment in the developing liver supports the expansion of megakaryocyte progenitors.</a> Blood Advances. 1 (21), 1854-1866 (2017).</li>
<li>Boscher, J., Gachet, C., Lanza, F., Léon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Megakaryocyte+culture+in+3D+methylcellulose-based+hydrogel+to+improve+cell+maturation+and+study+the+impact+of+stiffness+and+confinement%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3AJOVE%22%5BJournal%5D)">Megakaryocyte culture in 3D methylcellulose-based hydrogel to improve cell maturation and study the impact of stiffness and confinement.</a> Journal of Visualized Experiments:JOVE. , (2021).</li>
<li>Sanjuan-Pla, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet-biased+stem+cells+reside+at+the+apex+of+the+haematopoietic+stem-cell+hierarchy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Platelet-biased stem cells reside at the apex of the haematopoietic stem-cell hierarchy.</a> Nature. 502 (7470), 232-236 (2013).</li>
<li>Haas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation-driven+fast-track+differentiation+of+HSCs+into+the+megakaryocytic+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Hematology%22%5BJournal%5D)">Inflammation-driven fast-track differentiation of HSCs into the megakaryocytic lineage.</a> Experimental Hematology. 42 (8), 14(2014).</li>
<li>Shin, J. Y., Hu, W., Naramura, M., Park, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+c-Kit+expression+identifies+hematopoietic+stem+cells+with+impaired+self-renewal+and+megakaryocytic+bias%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">High c-Kit expression identifies hematopoietic stem cells with impaired self-renewal and megakaryocytic bias.</a> The Journal of Experimental Medicine. 211 (2), 217-231 (2014).</li>
</ol>

ولا يعلن صاحبا البلاغ عن وجود مصالح مالية متنافسة.

الطريقة الموصوفة في هذه الورقة يسمح لاستخراج وتنقية الماوس MEP و MKp. وكان من السمات الهامة في تحسين البروتوكول الحصول على عدد كاف من الخلايا التي من شأنها أن تكون متوافقة مع معظم المقايسات الجزيئية والخلوية. عادة ما تتكون الممارسة العامة لجمع عظام الفأر لاستخراج الخلايا المكونة للدم في حصاد كل من عظم الفخذ والساق لكل فأر. وبالتالي غالبا ما يتم تجاهل عظم الحوض ، وهو مصدر آخر للمواد الدموية. أسباب عدم جمع قمة الحرقفي هو ضعف المعرفة من التشريح الداخلي للهيكل العظمي للفأر وحقيقة أن المستخدمين يجمعون كلاسيكيا hindlimbs عن طر...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/t/62498">Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors</a>. A figure was updated.
Figure 2 was updated from:
<img alt="Hematopoietic cell separation diagram with flow cytometry result, showing Lin+ and Lin- fractions." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62498/62498fig02.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 2"> 
Figure 2: Magnetic depletion of lineage committed (Lin) cells. (A) Schematic representation of the magnetic depletion protocol. First, unsorted bone marrow cells are labeled with the biotin-conjugated rat anti-mouse antibody cocktail. Cells are then incubated with anti-rat Ig coated magnetic beads and subsequently subjected to the magnetic depletion using a strong magnet. The magnet will retain the labeled magnetic Lin+ fraction against the tube walls, while the unlabeled non-magnetic Lin- negative fraction will be collected in a new tube. (B) Lineage committed cells can be identified using fluorescent conjugated streptavidin. Typical analysis of the lineage expression in cells prior to magnetic depletion (total bone marrow) and after magnetic depletion (Lin- Fraction) N = 21. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62498/62498fig02large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
to:
<img alt="Hematopoietic cell separation process diagram with antibody labeling and magnet use, flow cytometry results." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62498/62498fig2v2.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 2"> 
Figure 2: Magnetic depletion of lineage committed (Lin) cells. (A) Schematic representation of the magnetic depletion protocol. First, unsorted bone marrow cells are labeled with the biotin-conjugated rat anti-mouse antibody cocktail. Cells are then incubated with anti-rat Ig coated magnetic beads and subsequently subjected to the magnetic depletion using a strong magnet. The magnet will retain the labeled magnetic Lin+ fraction against the tube walls, while the unlabeled non-magnetic Lin- negative fraction will be collected in a new tube. (B) Lineage committed cells can be identified using fluorescent conjugated streptavidin. Typical analysis of the lineage expression in cells prior to magnetic depletion (total bone marrow) and after magnetic depletion (Lin- Fraction) N = 21. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62498/62498fig2v2large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62498">Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors</a>. A figure was updated.

Erratum: Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors

يتم إنتاج الصفائح الدموية بواسطة الخلايا العملاقة. وتقع هذه الخلايا الكبيرة متعددة الأضلاع في نخاع العظام وبالنسبة لجميع خلايا الدم فهي مشتقة من الخلايا الجذعية الدموية (HSC)1. المسار الكلاسيكي لإنتاج megakaryocytes في نخاع العظام ينبع من HSC وينطوي على جيل من السلف المختلفة التي تقيد تدريجيا إمكاناتها التمايز2. أول سلف التوقيع على الالتزام النسب megakaryocytic هو Megakaryocyte-Erythrocyte السلف (MEP)، سلف ثنائي القدرة قادرة على إنتاج كل من خلايا الغدة الدرقية وmegakaryocytes3،4،5. ثم تنتج وزارة التربية والميكارسين سلف وحيد القدرة / السلائف (MKp) التي سوف تفرق إلى megakaryocyte ناضجة قادرة على إنتاج الصفائح الدموية. الآليات التي ينطوي عليها توليد هؤلاء السلف ، فضلا عن تمايزها ونضوجها في الخلايا العملاقة معقدة ومفهومة جزئيا فقط. وبالإضافة إلى ذلك، فإن عدم تجانس السكان MEP من حيث إمكانات التمايز ومستوى الالتزام الجوهري لهذه الخلايا لا تزال غير واضحة. ولفك رموز هذه العمليات، من الضروري الحصول على (أو الوصول إلى) مجموعات منقى من MEP و MKp لإجراء تحليلات جزيئية وخلايا واحدة دقيقة.
وقد أظهرت العديد من الدراسات مجموعات معينة من علامات سطح الخلية لتحديد السلف ملتزمة النسب megakaryocytic في الماوس6،7،8. من هذه تم ابتكار طريقة تسمح لتنقية MEP و MKp من الفئران. تم تحسين هذه الطريقة للحصول على خلايا في عدد كاف ونوعية لعدد كبير من المقايسات. مع الاعتبارات الأخلاقية في الاعتبار، ومن أجل تقليل عدد الحيوانات المشاركة في التجارب، ونحن استحثت لحصاد نخاع العظم من عظم الفخذ والساق، وأيضا من قمة الحرقفي. يحتوي هذا العظم على تردد عال وعدد من السلف الدموية ومعظم الوقت معطوب أثناء حصاد العظام الطويل. هنا هو طريقة مفصلة لجمع موثوق بها من هذه العظام.
المعيار الثاني للتحسين هو إنتاج مجموعات خلايا عالية النقاء. الفلورسنت تنشيط فرز الخلية (FACS) هو وسيلة للاختيار من أجل الحصول على السكان تنقية من الخلايا ذات الاهتمام. ومع ذلك، يتم الوصول إلى غلة منخفضة عندما يكون السكان الخلية من الفائدة نادرة جدا. ولذلك فإن إجراءات الإثراء ضرورية. في هذا البروتوكول، تم اختيار إجراء اختيار سلبي باستخدام الخرز المغناطيسي.

<table><tbody><tr><td>إبر قياس 21</td><td>BD Microlance</td><td>301155</td><td></td></tr><tr><td>7AAD</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9400</td><td></td></tr><tr><td>الأجسام المضادة Gr-1-biotin</td><td>eBioscience</td><td>13-5931-85</td><td>الاستنفاد المغناطيسي</td></tr><tr><td>الأجسام المضادة B220-biotin</td><td>eBioscience</td><td>13-0452-85</td><td>الاستنفاد المغناطيسي</td></tr><tr><td>الأجسام المضادة Mac-1-biotin</td><td>eBioscience</td><td>13-0112-85</td><td>المغناطيسي استنفاد</td></tr><tr><td>الأجسام المضادة CD3e-biotin</td><td>eBioscience</td><td>13-0031-85</td><td>النضوب المغناطيسي</td></tr><tr><td>الأجسام المضادة CD4-biotin</td><td>eBioscience</td><td>13-9766-82</td><td>النضوب المغناطيسي</td></tr><tr><td>الأجسام المضادة CD5-biotin</td><td>eBioscience</td><td>13-0051-85</td><td>استنفاد مغناطيسي</td></tr><tr><td>الأجسام المضادة CD8a-biotin</td><td>eBioscience</td><td>13-0081-85</td><td>الاستنفاد المغناطيسي</td></tr><tr><td>الأجسام المضادة TER119-biotin</td><td>eBioscience</td><td>13-5921-85</td><td>استنفاد مغناطيسي</td></tr><tr><td>الأجسام المضادة CD127-biotin</td><td>eBioscience</td><td>13-1271-85</td><td>الاستنفاد المغناطيسي</td></tr><tr><td>الأجسام المضادة CD45-FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-0451-85</td><td>فرز الخلايا</td></tr><tr><td>الأجسام المضادة CD45-PE</td><td>eBioscience</td><td>12-0451-83</td><td>فرز الخلايا</td></tr><tr><td>الأجسام المضادة TER119-APC</td><td>eBioscience</td><td>17-5921-83</td><td>فرز الخلايا</td></tr><tr><td>الأجسام المضادة CD45-PECy7</td><td>eBioscience</td><td>25-0451-82</td><td>فرز الخلايا</td></tr><tr><td>الأجسام المضادة CD45-biotin</td><td>eBioscience</td><td>13-0451-85</td><td>فرز الخلايا</td></tr><tr><td>الأجسام المضادة CD9-FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-0091-82</td><td>فرز الخلايا</td></tr><tr><td>الأجسام المضادة &nbsp; c-kit-APC</td><td>eBioscience</td><td>17-1171-83</td><td>فرز الخلايا</td></tr><tr><td>الأجسام المضادة Sca-1-PE</td><td>eBioscience</td><td>12-5981-83</td><td>فرز الخلايا</td></tr><tr><td>الأجسام المضادة CD16 / 32-PE</td><td>eBioscience</td><td>12-0161-83</td><td>فرز الخلايا</td></tr><tr><td>الأجسام المضادة CD150-PECy7</td><td>eBioscience</td><td>25-1502-82</td><td>ثقافة فرز</td></tr><tr><td>الخلايا المتوسطة StemSpan-SFEM</td><td>تقنيات الخلايا الجذعية</td> <td># 09650</td><td></td></tr><tr><td>وسادة تشريح</td><td>فيشر Scientific</td><td>10452395</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>الإيثانول</td><td>vWR للكيماويات</td><td>83813.360</td><td></td></tr><tr><td>ملقط</td><td>Euronexia</td><td>P-120-AS</td><td></td></tr><tr><td>ماصة زجاجية</td><td>باستور Dutscher</td><td>42011</td><td></td></tr><tr><td>مغناطيس :&nbsp; DynaMag-5</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12303D</td><td></td></tr><tr><td>الخرز المغناطيسي: Dynabeads Sheep Anti-Rat IgG</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11035</td><td></td></tr><tr><td>تقنيات الخلايا الجذعية</td> <td>الضخمة # 04970</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MethoCult SF M3436</td><td>تقنيات الخلايا الجذعية</td> <td># 03436</td><td></td></tr><tr><td>مصل العجل حديثي الولادة</td><td>Dutscher</td><td>50750-500</td><td></td></tr><tr><td>تحلل الخلايا الحمراء حل</td><td>BD Bioscience</td><td>555899</td><td></td></tr><tr><td>مشارط</td><td>فيشر 12308009</td><td></td><td></td>العلمية</tr><tr><td>مقص</td><td>Euronexia</td><td>C-165-ASB</td><td></td></tr><tr><td>محاقن معقمة 1 مل</td><td>BD Bioscience</td><td>303172</td><td></td></tr><tr><td>أنابيب معقمة 15 مل</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.502</td><td></td></tr> أنابيب <tr><td>بولي بروبلين معقمة 5 مل</td><td>Falcon</td><td>352063</td><td></td></tr> أنابيب <tr><td>البوليسترين المعقمة 5 مل Falcon</td><td></td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>أنابيب معقمة مع 70 & مايكرو ؛ غطاء مصفاة الخلية m</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>طبق بتري معقم</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin-APC-Cy7</td><td>BD Biosciences</td><td>554063</td><td>أسطوانة أنبوب فرز الخلايا</td></tr><tr><td></td><td>المعياري Scientific</td><td>R3005</td><td></td></tr></tbody></table>

عزل السلف ميغاكاريوسيت الماوس

Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors

خلايا نخاع العظم الضخمة هي خلايا متعددة الأضلاع كبيرة تضمن إنتاج الصفائح الدموية. أنها تنشأ من الخلايا الجذعية الدموية من خلال megakaryopoiesis. المراحل النهائية من هذه العملية معقدة وتنطوي كلاسيكيا على السلف Megakaryocyte-Erythrocyte ثنائي القدرة (MEP) وسلفات Megakaryocyte أحادية القدرة (MKp). هذه المجموعات السكانية تسبق تشكيل الخلايا الضخمة حسنة النية ، وعلى هذا النحو ، يمكن عزلها وتوصيفها تسمح للتحليل قوية وغير متحيزة لتشكيل megakaryocyte. يقدم هذا البروتوكول بالتفصيل الإجراء لجمع الخلايا الدموية من نخاع عظم الفأر ، وإثراء السلف الدموية من خلال الاستنفاد المغناطيسي وأخيرا استراتيجية فرز الخلايا التي تسفر عن مجموعات MEP و MKp شديدة النقاء. أولا، يتم جمع خلايا نخاع العظم من عظم الفخذ، والساق، وأيضا قمة الحرقفي، وهو العظم الذي يحتوي على عدد كبير من السلف الدموية. استخدام عظام قمة الحرقفي يزيد بشكل كبير من إجمالي عدد الخلايا التي تم الحصول عليها لكل فأر، وبالتالي يساهم في استخدام أكثر أخلاقية للحيوانات. تم تحسين استنفاد النسب المغناطيسي باستخدام حبات مغناطيسية 450 نانومتر مما يسمح لفرز الخلايا بكفاءة عالية عن طريق قياس التدفق الخلوي. وأخيرا ، فإن البروتوكول يقدم وضع العلامات وgating استراتيجية لفرز اثنين من السكان السلف megakaryocyte تنقية عالية : MEP (لين--SCA - 1--ج كيت+CD16/32--CD150+CD9خافت)وMKP (لين-- SCA - 1--ج كيت+CD16/32--CD150+CD9مشرق ). هذه التقنية سهلة التنفيذ وتوفر ما يكفي من المواد الخلوية لأداء 1) التوصيف الجزيئي لمعرفة أعمق لهويتها وبيولوجيتها ، 2) في اختبارات التمايز المختبري ، من شأنها أن توفر فهما أفضل لآليات نضوج الخلايا العملاقة ، أو 3) في نماذج المختبر للتفاعل مع بيئتها الدقيقة.

تم إجراء تحليل Phenotypic للخلايا التي تم تحديدها على أنها MEP و MKp عن طريق قياس التدفق الخلوي. وسمت الخلايا بأجسام مضادة مضانة مترافقة مع CD41a وCD42c، وهي علامات كلاسيكية للنساب الضخمة والصفائح الدموية. وأعرب عن كل من علامات من قبل خلايا السكان MKP في حين لم يتم الكشف عن هذه العلامات حتى الآن على سطح خلايا السكان MEP (الشكل 4Ai، 4Aii). بوليبلويدي هو السمة المميزة للخلايا العملاقة. كما تم تحليل محتوى الحمض النووي للسكان فرزها وأظهرت أن الخلايا هي في معظمها 2N للسكان MEP ون...

تصف هذه الطريقة تنقية التدفق الخلوي ل MEP و MKp من عظام الفخذ والساق وعظام الحوض.

Bone marrow megakaryocytes are large polyploid cells that ensure the production of blood platelets. They arise from hematopoietic stem cells through ...

عزل المجموعات السكانية الرئيسية Megakaryocyte السلف، يسمح للتحليل الدقيق للتسلسل الهرمي النسب في ثقافة الخلية على المقايسات الجزيئية، حتى مستوى الخلية الواحدة. يجمع هذا البروتوكول بين ممارسة أكثر أخلاقية من خلال تقليل عدد الحيوانات المطلوبة ، في عملية فعالة لفرز الخلايا من مجموعات MEP و MKP. للعظم، وجمع رذاذ الجسم من ثمانية إلى 12 أسبوعا C57 الأسود ستة الماوس، مع 70٪الإيثانول.استخدام مقص لجعل نقطة 5-1 سنتيمتر شق الجلد، عمودي على العمود الفقري. وتمزيق الجلد حول الجسم كله، عن طريق سحبه إلى أسفل. ضع وجه الفأرة لأسفل على لوحة التشريح ، ثم حدد عظام الحوض عن طريق انزلاق الأصابع أو المقص ، على طول العمود الفقري المكشوف ، من أعلى إلى أسفل.لتحديد موقع قمة الحرقفي، حدد عثرة صغيرة في المنطقة القطنية بالقرب من الأطراف الخلفية. بعد وضع مقص موازية للعمود الفقري، ضد الفقرات، وعلى مقربة من عثرة قمة الحرقفي، والمضي قدما في قطع العضلات على طول الجانب من العمود الفقري فوق عظم الحوض، عن طريق انزلاق مقص على طول الفقرات، وصولا الى الذيل. ثم قطع بين الفقرات وقمة الحرقفي، والبقاء على مقربة من الفقرات قدر الإمكان.وقطع العضلات المتبقية لفصل الطرف من الجسم. نقل الأطراف المنفصلة إلى سطح نظيف. بعد التخلص من بقية الجسم وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية، استخدم ملقط ومشرط لفضح عظام الحوض والفخذ والظنبوب، عن طريق إزالة الأنسجة المحيطة بها.استخدم ملقطا للاحتفاظ بالطرف القاصي من عظم الفخذ ، وخلع رأس الفخذ بعناية من عظم الحوض ، عن طريق تقطيع العضلات بلطف حول المفصل بمشرط. كشط قبالة العضلات المتبقية من عظم الحوض، وقطع في منتصف التجويف الذي عقد رأس الفخذ. الحفاظ على الهيليوم والتخلص من الجانب رقيقة الثلاثي من العظام.باستخدام مشرط، وإزالة الأنسجة المتبقية حول الهيليوم، ووضع العظام تنظيفها في برنامج تلفزيوني عقيم تكملها 2٪ مصل العجل حديثي الولادة. ثم استخدم مقص لقطع القدم من الساق في الكاحل. عقد الجزء السفلي من الساق مع ملقط، كشط العضلات حتى نحو الركبة.تجاهل الشظية. ثم جعل قطع عبر الهضبة الظنبوبية مع مشرط، ووضع الساق في برنامج تلفزيوني عقيم 2٪NBCS. بعد إزالة الأنسجة المتبقية حول عظم الفخذ، عقد الجانب العلوي من عظم الفخذ مع ملقط، ووضع شفرة مشرط في قاعدة الرضفة.تطبيق قوة نحو الرضفة، بالتوازي مع عظم الفخذ لفصل الرضفة. ثم ضع عظم الفخذ، في برنامج تلفزيوني عقيم 2٪NBCS. في خزانة تدفق صفح، نقل العظام إلى طبق بيتري عقيمة مليئة برنامج تلفزيوني عقيم 2٪NBCS.استخدام مشرط لقطع رأس عظم الفخذ. ملء حقنة ملليلتر واحد مع برنامج تلفزيوني معقم 2٪ NBCS، وإرفاق إبرة قياس 21، إلى منفذ. ثم ملء أنبوب البولي بروبلين خمسة ملليلتر مع اثنين من ملليلتر من برنامج تلفزيوني عقيم 2٪ NBCS.عقد عظم الفخذ مع ملقط، إدراج الإبرة في الأخدود اليسار، بعد إزالة الرضفة عن طريق تطبيق التناوب، وضمان أن يتم إدراج الإبرة تماما في العظام، حتى شطبة. بعد إدخال الإبرة، نقل العظام مع الإبرة في أنبوب يحتوي على اثنين من ملليلتر من برنامج تلفزيوني 2٪NBCS. ثم الاستغناء عن وتوبيخ برنامج تلفزيوني 2٪ NBCS، من الحقنة حتى العظام واضحة.إزالة الإبرة من عظم الفخذ، وإدراجه في حفرة في الجانب الآخر، حيث كان رأس عظم الفخذ. بعد الاستغناء عن المخزن المؤقت وقرصنة، تجاهل العظام. لقمة الحرقفي والساق، استخدم ملقط لعقد العظام وإدراج الإبرة بلطف في الجانب المفتوح، عن طريق تطبيق التناوب.ضمان إدخال الإبرة بالكامل في العظم، حتى الشارف. ثم نقل العظام مع الإبرة في أنبوب يحتوي على اثنين من ملليلتر من برنامج تلفزيوني 2٪ NBCS. الاستغناء عن وتوبيخ برنامج تلفزيوني 2٪ NBCS من الحقنة حتى العظام واضحة.تمرير كل تعليق الخلية من خلال غطاء 40 ميكرون مصفاة الخلية, وضعت على أنبوب البوليسترين خمسة ملليلتر عقيمة, وإضافة 500 ميكرولتر من PBS 2٪ NBCS. خصص 100 ميكرولتر من تعليق الخلية كنخاع عظمي كامل. ثم تخزينه على الجليد لإجراء تلطيخ.بيليه تعليق تصفيتها عن طريق الطرد المركزي. بعد التخلص من الناموست، أعيد إنفاق بيليه في كوكتيل الأجسام المضادة الأولية الطازجة، مع الحضانة على الجليد، لمدة 30 إلى 45 دقيقة. جانبا 10 ميكرولتر من تعليق الخلية في أنبوب البوليسترين خمسة ملليلتر معقمة، وصفت لين المسام كسر، وإضافة 90 ميكرولتر من PBS 2٪NBCS.وفي الوقت نفسه، وإعداد الخرز للنضوب المغناطيسي، عن طريق إعادة تعليق لهم في القارورة، مع دوامة شاملة لمدة 30 ثانية. نقل حجم من الخرز المقابلة لاثنين من الخرز لكل خلية الهدف، في أنبوب البولي بروبلين خمسة ملليلتر، وغسل الخرز مرتين، مع برنامج تلفزيوني 2٪NBCS، عن طريق وضع أنبوب على المغناطيس. بعد إزالة العازلة الغسيل مع ماصة المبستر الزجاج العقيم، resuspend الخرز في 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني عقيم 2٪ NBCS.للخطوة الأولى من الاستنفاد المغناطيسي، إضافة 250 ميكرولتر من الخرز على بيليه من الخلايا المغسولة، واحتضان مع خلط لطيف لمدة خمس دقائق على الجليد. ثم أضف اثنين من ملليلتر من برنامج تلفزيوني عقيم 2٪ NBCS، مع خلط لطيف، ووضع الأنبوب في المغناطيس لمدة دقيقتين. المضي قدما لجمع كسر غير المغناطيسي مع ماصة المبستر الزجاج العقيم.وللخطوة الثانية من النضوب المغناطيسي، أضفه إلى 250 ميكرولتر المتبقية من الخرز المغناطيسي. ضع الأنبوب مختوما بالبارافين على أسطوانة أنبوبية ، لمدة 20 دقيقة عند أربع درجات مئوية. ثم أضف اثنين من ملليلتر من برنامج تلفزيوني عقيم 2٪ NBCS مع خلط لطيف.وضع الأنبوب مع المغناطيس لمدة دقيقتين. جمع الكسر غير المغناطيسي في أنبوب البولي بروبلين خمسة ملليلتر معقمة، وصفت، غير المغناطيسي لين كسر، مع ماصة المعجنات الزجاج العقيم، والمضي قدما في فرز الخلايا megakaryocytes السلف، كما هو موضح في المخطوطة النصية. بالنسبة لاستراتيجية gating لفرز الخلايا ، في السكان لين نيغ ، يتم تحديد الخلايا التي تعبر عن C - عدة ، وانخفاض إلى أي تعبير عن Sca - 1 أو CD16 / 32 مستضد.في هذه الفئات السكانية، يتم تحديد MEP كخلايا إيجابية CD150 وCD9 باهتة. وMKP كما CD150 إيجابية، وCD9 الخلايا الساطعة. في تحليل التدفق الخلوي التمثيلي ، وصفت الخلايا التي تم تحديدها على أنها MEP و Mkp ، بالأجسام المضادة المترافقة الفلورية ل CD41a ، والعلامات الكلاسيكية CD42c ، للنساب الضخمة والصفائح الدموية.تم التعبير عن كلتا العينتين من قبل خلايا مجموعة MKp ، ولم يتم اكتشافها على سطح خلايا سكان MEP. محتوى الحمض النووي للخلايا الضخمة فرزها، أظهرت أن الخلايا هي في الغالب 2n للسكان MEP. وجزء صغير من خلايا MKp غريبة.ولم يتم الكشف عن خلايا الحيل العالية بشكل كبير في هذه المجموعات السكانية. في المقايسات شبه الصلبة الكلونوجينية ، تم الكشف عن CFU-MK في كل من MEP و MKp. لم يتم الكشف عن BFU-E في السكان MKp، ولكن الكشف عنها في MEP و، CD150 السلبي CD9 السكان الخلية السلف خافت.تظهر الملاحظة المجهرية في اليوم الثالث من التمايز أن MEP و MKp أنتجا خلايا عملاقة بشكل رئيسي ، تم تحديدها كخلايا كبيرة. تم تحديد الخلايا الضخمة التي تم الحصول عليها بعد ثلاثة أيام من الثقافة ، باستخدام تعبير CD41 و CD42c ، وتمثل 54 ، و 82٪ من الخلايا المنتجة من مجموعات خلايا MEP و MKp ، على التوالي. كانت حيلة الخلايا الضخمة المنتجة ، أكبر من الخلايا الضخمة المشتقة من سكان MKp ، وقارنتها بسكان MEP.فقط الخلايا المشتقة من السكان MKp، كانت قادرة على انبعاث البربليتليت، مما يشير إلى مرحلة نضوج أكثر تقدما للسكان MKp. استخدام عظم الحوض ، يزيد بشكل كبير إلى عدد الخلايا ، في حين أن الاستنفاد المغناطيسي من خطوتين يحسن فعالية استنفاد النسب. يسمح هذا البروتوكول بالثقافة اللاحقة ل MEP و MKp من الخلايا المفردة ، والتي ، إلى جانب التحليل النسخي والبروتيوميكي ، سيتعين عليها بالتأكيد فك رموز الآليات المعنية ، والنشأة الحيوية المنفذة.

isolation-of-mouse-megakaryocyte-progenitors

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

طريقة لتفارق الأنزيمية ، ووضع العلامات السطحية وتنقية بواسطة الخلوي تدفق الليفي / مكون الشحم والأسلاف عضلي من الهيكل العظمي والعضلات الفئران.

تنقية الأسلاف من الهيكل العظمي والعضلات

تم وصف طريقة لتحليل التوزيع من الأسلاف نخاع العظام المكونة للدم في التدفق الخلوي، وكذلك لعزل بكفاءة عالي النقاء الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs). ويستند أساسا لإجراء العزل في تخصيب المغناطيسي للخلايا + C-كيت والخلية فرز لتنقية HSCs للدراسات الخلوية والجزيئية.

المظهري التحليل وعزل الخلايا الجذعية المكونة للدم الفئران والأسلاف النسب، الملتزم

نقدم هنا بروتوكولا يولد كميات كبيرة من الخلايا الوحيدة الفئران من نخاع العظام غير المتجانسة للتطبيقات الانتقالية. بالمقارنة مع الآخرين ، تساعد هذه الطريقة الجديدة في تقليل عدد المضحية بها وخفض التكاليف عن طريق تجنب الطرق باهظة الثمن مثل فصل الخلايا المغناطيسية عالية التدرج (MACS).

عزل وحقن في الوريد من الفئران نخاع العظام المستمدة حيدات

للدم الجذعية والسلف الخلايا (HSPC) مستمدة من المتخصصة (مكون للدم) الخلايا البطانية خلال تطوير، ولكن لا يعرف الكثير عن العملية التي بعض الخلايا البطانية تحدد لتصبح تكوين الدم. ونحن لشرح طريقة التدفق الخلوي على أساس السماح العزلة في وقت واحد من الخلايا البطانية مكون للدم وHSPC من الأنسجة الجنينية في الفئران.

عزل خلايا الفئران الجنينية مكون للدم غشائي

&lt; p class = 'jove_content'&gt; نصف هنا بروتوكولا محسنا وقابلا للتكرار بدرجة كبيرة لعزل الخلايا السلفية للأديم المتوسط (MPCs) من نخاع العظام البشري (hBM). تميزت MPCs بقياس التدفق الخلوي والتعبير النستين. لقد أظهروا القدرة على إحداث مزارع خلايا شبيهة ب MSC تنمو بشكل كبير مع الاحتفاظ بإمكاناتها الوعائية.

عزل خلايا Mesangiogenic السلف (البلدان المتوسطية الشريكة) من نخاع العظام البشرية

يصف لنا عزلة إيمونوماجنيتيك oligodendrocytes الماوس الأساسي، الذي يسمح لعزل الخلايا في المختبر الثقافة سريعة ومحددة.

عزل إيمونوماجنيتيك سريعة ومحددة من الماوس Oligodendrocytes الأولية

ونحن لشرح كيفية تحديد وعزل 6 مجموعات فرعية من فروعه النقوي من مورين نخاع العظام باستخدام مزيج من المغناطيسية والأسفار الفرز (أجهزة ماكينتوش ونظام مراقبة الأصول الميدانية). يمكن استخدام هذا البروتوكول في المختبر فحوصات الثقافة (الثقافات methylcellulose أو السائل) و في فيفو المتبنيين نقل التجارب وتحاليل الحمض النووي الريبي/البروتين.

تحديد وعزل أوليجوبوتينت والنسب التي ارتكبت النقوي موروث من نخاع العظام الماوس

هنا، ونحن بالتفصيل طريقة explant نخاع العظم، من إعداد العينة لتحليل الشريحة المجهرية، لتقييم قدرة megakaryocytes التي تمايزت في بيئتها الفسيولوجية لتشكيل الصفائح.

ديناميات تشكيل الصفائح الدموية من الفأر نخاع العظم الطازج Explants

ومن المسلم به الآن أن البيئة ثلاثية الأبعاد للخلايا يمكن أن تلعب دورا هاما في سلوكها، والنضج و / أو التمايز. يصف هذا البروتوكول نموذج ثقافة الخلايا ثلاثي الأبعاد المصمم لدراسة تأثير الاحتواء المادي والقيود الميكانيكية على الخلايا العملاقة.

Megakaryocyte الثقافة في هيدروجيل 3D ميثيلسليلوز القائم على تحسين نضوج الخلايا ودراسة تأثير تصلب والحبس

هنا ، نقدم بروتوكولا لعزل وتنقية الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية في النماذج الحيوانية لأمراض إزالة الميالين ، باستخدام فرز الخلايا المنشطة مغناطيسيا العمودي.

عزل الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية للفأر عن طريق فرز الخلايا المنشطة مغناطيسيا في النماذج الحيوانية لإزالة الميالين

أنشأت هذه الدراسة طريقة مستقرة وفعالة للعزل والثقافة والتحديد الوظيفي للخلايا الجذعية CD34 + المقيمة في جدار الأوعية الدموية (CD34 + VW-SCs). يمكن استخدام طريقة العزل سهلة المتابعة والفعالة من قبل باحثين آخرين لدراسة الآليات المحتملة التي تنطوي عليها أمراض القلب والأوعية الدموية.

العزل المغناطيسي المناعي للخلايا الجذعية CD34 + المقيمة في جدار الأوعية الدموية من الفئران

تعلم عزل السلف ميغاكاريوسيت من نخاع عظم الفئران باستخدام العرف الحرقفي لزيادة إنتاجية الخلايا. يتيح هذا البروتوكول الفعال إجراء تحليلات جزيئية ووظيفية دقيقة لفهم آليات تكوين الصفائح الدموية.

عزل السلف ميغاكاريوسيت الماوس

استكشف المزيد من الفيديوهات