Leukodepletion مرشحات المشتقة CD34 + الخلايا كمصدر الخلية لدراسة التمايز Megakaryocyte وتشكيل الصفائح الدموية

يقترح هذا البروتوكول طريقة بسيطة للحصول على السلف الدموية البشرية ، وتحفيز تمايزها إلى خلايا عملاقة. يمكن أن تكون بمثابة أساس لفهم أفضل ل megakaryopoiesis هذه التقنية يستخدم مصدرا، ولكن يوفر ميزة كونها بأسعار معقولة وفيرة للبحوث المختبرية في الدم. يتم استخدام هذه الطريقة لفهم أفضل megakaryopoiesis للخلية لاستخدامها في العلاج أنها سوف تحتاج إلى أن تكون مستعدة في ظروف GMP، وهو ما هو الحال حاليا.

فهم الخطوات بما في ذلك جمع PBMC يمكن أن تكون كاملة فقط مع مظاهرة بصرية. قبل البدء في تجربة، قم بتوصيل فلتر leukoreduction إلى كيس نقل فارغ 600 ملليلتر ولمجموعة أنابيب. في خزانة السلامة الحيوية حقن 25 ملليلتر من العازلة elution المصفاة لكل فلتر leukoreduction في كيس فارغ، واستخدام حقنة 30 ملليلتر لتنشق بلطف محتويات الحقيبة من خلال مرشح.

نقل خلايا الدم الحمراء التي تم جمعها إلى أنبوب جديد 50 ملليلتر, وتمييع تعليق الخلية إلى النصف مع 2٪ dextran. تخلط جيدا لتجميع خلايا الدم والسماح للخلايا إلى الرواسب لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. عندما استقر خلايا الدم الحمراء نقل supernatant إلى أنبوب 50 ملليلتر وملء الأنبوب مع اثنين من الحل EDTA برنامج تلفزيوني ملليمولار.

تراكب بلطف نصف supernatant على 25 ملليلتر من متوسط التدرج الكثافة في كل من اثنين من أنابيب 50 ملليلتر دون الإخلال السطح المتدرجة وفصل الخلايا عن طريق الطرد المركزي الانحدار الكثافة. استخدام ماصة المتاح لنقل الخلايا من كل واجهة إلى أنبوب 50 ملليلتر جديدة. غسل الخلايا مرتين في 50 ملليلتر من اثنين من ملليمولار PBS EDTA لكل غسل.

بعد الغسيل الثاني، أعد إنفاق الكريات في حجم واحد 50 ملليلتر من برنامج تلفزيوني جديد EDTA للعد. هنا من الممكن لوقف الإجراء عن طريق الحفاظ على الخلايا التي تم جمعها تحت التحريض في أربع درجات مئوية خلال الليل. لتحديد الخلية CD34 +، حدد رقم الخلية وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي وإعادة تثبيت بيليه الخلية في 300 ميكرولتر من اثنين من ملليمولار PBS EDTA لكل 10 إلى الخلايا الثامنة.

إضافة الحجم المناسب من مستقبلات FC حجب كاشف و 50 ميكرولتر من CD34 حبات صغيرة لكل 10 إلى الخلايا الثامنة. بعد 30 دقيقة في أربع درجات مئوية، وغسل الخلايا مع اثنين من ملليمولار PBS EDTA، وإعادة إنفاق بيليه في 500 ميكرولتر من اثنين من جديد ملليمولار PBS EDTA، لكل 10 إلى الخلايا الثماني. Humidify وحجم العمود المغناطيسي بشكل مناسب مع برنامج تلفزيوني EDTA، ومن ثم إضافة العينة إلى العمود.

اغسل العمود مرتين بثلاث ملليلترات من اثنين من ملليمولار PBS EDTA لكل غسل. قبل التملص من خلايا CD34 + ، مع اثنين من خمسة وحدات تخزين ملليلتر من اثنين من ملليمولار PBS EDTA لكل elution. لتقييم نقاء الخلايا المختارة من الخرز المغناطيسي ، أضف اثنين من الميكرويلترات من الأجسام المضادة المناسبة CD34 البشرية إلى 100 ميكرولتر aliquot من الخلايا المعزولة وتخلط جيدا قبل احتضان لمدة 15 دقيقة في أربع درجات مئوية.

بعد الحضانة، اغسل الخلايا في PBS وإعادة إنفاق بيليه في 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني لتحليل نقاء عينة الخلية عن طريق قياس التدفق الخلوي. بعد العد، وجمع خلايا CD34 + عن طريق الطرد المركزي وإعادة تعليق بيليه فورا في حل الباردة واحد إلى كثافة من 10 إلى الخلايا الست لكل ملليلتر قبل إضافة تعليق الخلية بسرعة إلى الحل البارد اثنين. ثم ضع أنبوب التبريد على الفور في ثلاجة ناقص 80 درجة مئوية لمدة 24 ساعة قبل نقل أنبوب التبريد إلى تخزين النيتروجين السائل.

في هذه الدراسة التمثيلية، تم استرداد الخلايا عن طريق ترشيح الكريات البيضاء كما هو موضح مع قابلية البقاء حوالي 95٪. بعد اختيار حبة مغناطيسية، تم الحصول على أكبر من 90٪ صافي CD34 + السكان الخلية. عادة ما ينخفض انتشار الخلايا بعد أسبوع من الثقافة ، ولكن مع عدم وجود تغييرات كبيرة في صلاحية الخلية.

بحلول اليوم السابع ، يجب أن تبدأ خلايا CD34 + في التعبير عن CD41 ، وهي علامة محددة ومبكرة أو لتطوير الخلايا الضخمة والصفائح الدموية. بحلول اليوم 10 ، تتطور غالبية الخلايا في الثقافة عادة إلى CD41 ناضجة تعبر عن الخلايا الضخمة. بحلول اليوم 13 ، يمكن ملاحظة تمديد الصفائح الدموية المؤيدة للخلايا الضخمة وإطلاق الصفائح الدموية عن طريق المجهر الخفيف.

يمكن بعد ذلك تحديد العدد الإجمالي للصفائح الدموية الإيجابية CD41 و CD42 و 8 التي تم إطلاقها في الثقافة باستخدام عدد معايرة من حبات الفلورسنت. تمهد هذه الطريقة الطريق لتعزيز الآليات الأساسية للكتل الضخمة وزيادة غلة الصفائح الدموية في البصرية. حتى لو كانت هذه الطريقة تبدو مملة، فمن السهل جدا تحتاج فقط إلى التحلي بالصبر وإعداد جميع المناطق مقدما.

على الرغم من أن مخاوفنا الحرجة megakaryopoiesis نحصل على خلايا CD42 يمكن استخدامها في أكثر من مسارات الدم.