Name: في فيفو تصوير فوتونين لخلايا ميجاكاريوسيت وبروبليتس في نخاع عظم جمجمة الفأر (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-28T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: تعلم تصوير خلايا ميجاكاريوسيت وبروبليتس في نخاع عظم جمجمة الفأر باستخدام المجهر ثنائي الفوتون. تتيح هذه الطريقة دراسة تكوين الصفائح الدموية في الظروف الفسيولوجية الحقيقية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ويود المؤلفون أن يشكروا فلوريان غايرتنر (معهد العلوم والتكنولوجيا في النمسا، كلوستيرنيوبورغ، النمسا) على مشورته الخبيرة بشأن تجارب المجهر ثنائي الفوتون في الوقت الذي أنشأنا فيه هذه التقنية في المختبر، وإيف لوتز في مركز التصوير IGBMC/CBI (إيلكيرش، فرنسا) على خبرته ومساعدته في المجهر ذو الفوتونين. كما نشكر جان إيف رينكل على مساعدته التقنية وإينس غينار على رسم المخطط في الشكل 1. ونشكر جمعية منظمة أطباء بلا حدود ومنظمة سانت بوبليك على دعمها في اقتناء المجهر ثنائي الفوتون. وقد تم دعم AB من خلال زمالات ما بعد الدكتوراه من Etablissement Français du Sang (APR2016) ومن وكالة الأنباء الوطنية دي لا ريشرش (ANR-18-CE14-0037-01).

<ol><li>Junt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+visualization+of+thrombopoiesis+within+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dynamic visualization of thrombopoiesis within bone marrow.</a> Science. 317 (5845), 1767-1770 (2007).</li>
<li>Mazo, I. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+progenitor+cell+rolling+in+bone+marrow+microvessels%3A+parallel+contributions+by+endothelial+selectins+and+vascular+cell+adhesion+molecule+1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimenal+Medicine%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic progenitor cell rolling in bone marrow microvessels: parallel contributions by endothelial selectins and vascular cell adhesion molecule 1.</a> Journal of Experimenal Medicine. 188 (3), 465-474 (1998).</li>
<li>Bornert, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoskeletal-based+mechanisms+differently+regulate+in+vivo+and+in+vitro+proplatelet+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Cytoskeletal-based mechanisms differently regulate in vivo and in vitro proplatelet formation.</a> Haematologica. , (2020).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphingosine+kinase+2+%28Sphk2%29+regulates+platelet+biogenesis+by+providing+intracellular+sphingosine+1-phosphate+%28S1P%29%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Sphingosine kinase 2 (Sphk2) regulates platelet biogenesis by providing intracellular sphingosine 1-phosphate (S1P).</a> Blood. 122 (5), 791-802 (2013).</li>
<li>Kowata, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+demand+modulates+the+type+of+intravascular+protrusion+of+megakaryocytes+in+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Platelet demand modulates the type of intravascular protrusion of megakaryocytes in bone marrow.</a> Thrombosis and Haemostasis. 112 (4), 743-756 (2014).</li>
<li>Nishimura, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-1alpha+induces+thrombopoiesis+through+megakaryocyte+rupture+in+response+to+acute+platelet+needs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">IL-1alpha induces thrombopoiesis through megakaryocyte rupture in response to acute platelet needs.</a> Journal of Cell Biology. 209 (3), 453-466 (2015).</li>
<li>Lefrancais, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lung+is+a+site+of+platelet+biogenesis+and+a+reservoir+for+haematopoietic+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The lung is a site of platelet biogenesis and a reservoir for haematopoietic progenitors.</a> Nature. 544 (7648), 105-109 (2017).</li>
<li>Potts, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+budding+is+a+major+mechanism+of+in+vivo+platelet+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Membrane budding is a major mechanism of in vivo platelet biogenesis.</a> Journal of Experimental Medicine. 217 (9), 20191206(2020).</li>
<li>Scott, M. K., Akinduro, O., Lo Celso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+4-dimensional+tracking+of+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+in+adult+mouse+calvarial+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">In vivo 4-dimensional tracking of hematopoietic stem and progenitor cells in adult mouse calvarial bone marrow.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e51683(2014).</li>
<li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).</li>
<li>Tiedt, R., Schomber, T., Hao-Shen, H., Skoda, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pf4-Cre+transgenic+mice+allow+the+generation+of+lineage-restricted+gene+knockouts+for+studying+megakaryocyte+and+platelet+function+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Pf4-Cre transgenic mice allow the generation of lineage-restricted gene knockouts for studying megakaryocyte and platelet function in vivo.</a> Blood. 109 (4), 1503-1506 (2007).</li>
<li>Pertuy, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broader+expression+of+the+mouse+platelet+factor+4-cre+transgene+beyond+the+megakaryocyte+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Broader expression of the mouse platelet factor 4-cre transgene beyond the megakaryocyte lineage.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 13 (1), 115-125 (2015).</li>
<li>Calaminus, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+tracing+of+Pf4-Cre+marks+hematopoietic+stem+cells+and+their+progeny%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Lineage tracing of Pf4-Cre marks hematopoietic stem cells and their progeny.</a> PLoS One. 7 (12), 51361(2012).</li>
<li>Stegner, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombopoiesis+is+spatially+regulated+by+the+bone+marrow+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Thrombopoiesis is spatially regulated by the bone marrow vasculature.</a> Nature Communications. 8 (1), 127(2017).</li>
<li>Drew, P. J., Blinder, P., Cauwenberghs, G., Shih, A. Y., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+determination+of+particle+velocity+from+space-time+images+using+the+Radon+transform%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Computational+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Rapid determination of particle velocity from space-time images using the Radon transform.</a> Journal of Computational Neuroscience. 29 (1-2), 5-11 (2010).</li>
<li>Nakagawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ketamine+suppresses+platelet+aggregation+possibly+by+suppressed+inositol+triphosphate+formation+and+subsequent+suppression+of+cytosolic+calcium+increase%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Ketamine suppresses platelet aggregation possibly by suppressed inositol triphosphate formation and subsequent suppression of cytosolic calcium increase.</a> Anesthesiology. 96 (5), 1147-1152 (2002).</li>
<li>Kim, S., Lin, L., Brown, G. A. J., Hosaka, K., Scott, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extended+time-lapse+in+vivo+imaging+of+tibia+bone+marrow+to+visualize+dynamic+hematopoietic+stem+cell+engraftment%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Extended time-lapse in vivo imaging of tibia bone marrow to visualize dynamic hematopoietic stem cell engraftment.</a> Leukemia. 31 (7), 1582-1592 (2017).</li>
<li>Kohler, A., Geiger, H., Gunzer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+hematopoietic+stem+cells+in+the+marrow+of+long+bones+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Imaging hematopoietic stem cells in the marrow of long bones in vivo.</a> Methods in Molecular Biology. 750, 215-224 (2011).</li>
<li>Lewandowski, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+cellular+imaging+pinpoints+the+role+of+reactive+oxygen+species+in+the+early+steps+of+adult+hematopoietic+reconstitution%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">In vivo cellular imaging pinpoints the role of reactive oxygen species in the early steps of adult hematopoietic reconstitution.</a> Blood. 115 (3), 443-452 (2010).</li>
<li>Reismann, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+intravital+imaging+of+the+femoral+bone+marrow+reveals+plasticity+within+marrow+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Longitudinal intravital imaging of the femoral bone marrow reveals plasticity within marrow vasculature.</a> Nature Communications. 8 (1), 2153(2017).</li>
<li>Chen, Y., Maeda, A., Bu, J., DaCosta, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Femur+window+chamber+model+for+in+vivo+cell+tracking+in+the+murine+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Femur window chamber model for in vivo cell tracking in the murine bone marrow.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (113), e542205(2016).</li>
<li>Guesmi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-color+deep-tissue+three-photon+microscopy+with+a+multiband+infrared+laser%5BTitle%5D)+AND+%22Light+Science+%26+Applications%22%5BJournal%5D)">Dual-color deep-tissue three-photon microscopy with a multiband infrared laser.</a> Light Science & Applications. 7, 12(2018).</li>
<li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-photon+imaging+of+mouse+brain+structure+and+function+through+the+intact+skull%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Three-photon imaging of mouse brain structure and function through the intact skull.</a> Nature Methods. 15 (10), 789-792 (2018).</li>
<li>Kim, J., Bixel, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+multiphoton+imaging+of+the+bone+and+bone+marrow+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Intravital multiphoton imaging of the bone and bone marrow environment.</a> Cytometry A. 97 (5), 496-503 (2020).</li>
</ol>

ولا يوجد لدى صاحبي البلاغ تضارب في المصالح يعلنانه.

تعتمد آليات تكوين الصفائح الدموية بشكل كبير على بيئة نخاع العظم. ومن ثم، أصبح الفحص المجهري داخل الفيتية أداة هامة في الميدان لتصور العملية في الوقت الحقيقي. يمكن الحصول على الفئران ذات الخلايا الضخمة الفلورية عن طريق عبور الفئران التي تعبر عن إعادة دمج Cre في الخلايا الضخمة مع أي فئران مراسلة متخبطة تحتوي على كاسيت تعبير جيني فلوري مشروط. هنا، تم استخدام الفئران مراسل mTmG (B6.129 (CG)-Gt(ROSA)26Sortm4 (ACTB-tdTomato،-EGFP)Luo10)عبرت مع الفئران Pf4-cre11،مما يسمح مكثفة الفلورس...

يتم إنتاج الصفائح الدموية بواسطة خلايا متخصصة في الخلايا الضخمة الموجودة في نخاع العظام. ظلت الطريقة الدقيقة لإطلاق الخلايا الضخمة الصفائح الدموية في الدورة الدموية غير واضحة منذ فترة طويلة بسبب التحدي التقني في مراقبة الأحداث في الوقت الحقيقي من خلال العظام. وقد ساعد المجهر ثنائي فوتون في التغلب على هذا التحدي وأدى إلى تقدم كبير في فهم عملية تكوين الصفائح الدموية. أول في الجسم الحي megakaryocyte الملاحظات التي أدلى بها فون أندريان وزملاؤه في عام 2007 ، مع تصور megakaryocytes الفلورسنت من خلال الجمجمة1. وكان ذلك ممكنا لأن طبقة العظام في الجمجمة الأمامية للفئران البالغة الشباب لديها سمك بضع عشرات من الميكرونات وشفافة بما فيه الكفاية للسماح تصور الخلايا الفلورية في نخاع العظام الكامنة2.
الدراسات التي تلت ذلك تطبيق هذا الإجراء لتقييم تشكيل البروبليت في ظل ظروف مختلفة وفك الآليات الأساسية3،4،5،6. قدمت هذه الدراسات دليلا قاطعا على أن الخلايا العملاقة توسع بشكل ديناميكي نتوءات ، تسمى الصفائح ، من خلال الحاجز البطاني للأوعية الجيبية(الشكل 1). ثم يتم تحرير هذه الصفائح الدموية كشظايا طويلة تمثل عدة مئات من الصفائح الدموية في الحجم. سيتم تشكيل الصفائح الدموية بعد إعادة عرض الصفائح في دوران الأوعية الدقيقة لأعضاء المصب ، ولا سيما في الرئتين7. غير أن العملية الدقيقة والآليات الجزيئية لا تزال حتى الآن موضع نقاش. على سبيل المثال ، يختلف الدور المقترح للبروتينات الهيكل الخلوي في استطالة الصفائح الدموية بين المختبر وفي ظروف الجسم الحي 3، وقد أظهرت الاختلافات في تكوين البروبليتليت في ظل الظروف الالتهابية6. ومما يزيد الأمور تعقيدا، أن دراسة حديثة اعترضت على المفهوم القائم على البربليتليت واقترحت أنه في الجسم الحي،تتشكل الصفائح الدموية بشكل أساسي من خلال آلية ناشئة عن الأغشية على مستوى الخلايا العملاقة8.
تقدم هذه الورقة بروتوكولا لمراقبة الخلايا العملاقة واللوحات البربليتية في نخاع العظم من عظم الجمجمة في الفئران الحية ، باستخدام إجراء طفيف التوغل. وقد وصفت نهج مماثلة سابقا لتصور خلايا النخاع الأخرى, لا سيما الجذعية الدموية والخلايا السلف9. ينصب التركيز هنا على مراقبة الخلايا الضخمة والصفائح الدموية لتفصيل بعض المعلمات التي يمكن قياسها ، ولا سيما مورفولوجيا الصفائح الدموية وسرعة الصفائح الدموية. يقدم هذا البروتوكول كيفية إدخال قسطرة في الوريد الوداجي لحقن المقتفيات الفلورية والمخدرات ومراقبة من خلال عظم الجمجمة. يتم الكشف عن عظم الجلجلة باستخدام جراحة بسيطة بحيث يتم لصقها على حلقة إلى العظام. يعمل هذا الخاتم على شل حركة الرأس ومنع الحركات بسبب التنفس وتشكيل كوب مليء بالمحلول الملحي كوسيلة غمر للعدسة. هذه التقنية هي مناسبة تماما ل i) مراقبة في الوقت الحقيقي هندسة الجيوب الأنفية وmegakaryocytes التفاعل مع جدار السفينة. ii) اتبع megakaryocytes في عملية تشكيل البروبليت، استطالة، والإفراج؛ و3) قياس حركات الصفائح الدموية لرصد تدفق الدم الجيوب الأنفية المعقدة. البيانات التي تم الحصول عليها باستخدام هذا البروتوكول تم نشرها مؤخرا3.

<table><tbody><tr><td>برنامج GNU Octave</td> مشروع <td>GNU</td><td></td><td>https://www.gnu.org/software/octave/</td></tr><tr><td>&nbsp; هيستواكريل 5 × 0 ، 5 مل</td><td>براون</td><td>1050052</td><td>محلول قابل للحقن من الغراء الجراحي</td></tr><tr><td>كاشفات HyD الهجينة Leica Microsystems 4tunes</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>مشروع</td><td></td> GNU <td>الحد الأدنى من الإصدار المطلوب</td></tr><tr><td>Imalgene / Ketamine 1000 fl / 10 مل</td><td>Boehring</td><td>03661103003199</td><td>حماية العين</td></tr><tr><td>مجهر غوص Leica SP8 MP مزود بهدف مائي 25x ، فتحة عددية تبلغ 0.95</td><td>Leica Microsystems</td><td></td> إثارة <td>متزامنة ل AlexaFluor-488 و Qtracker-655</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>MathWorks</td><td></td><td>https://www.mathworks.com/</td></tr> <tr><td>Ocrygel 10 g</td><td>Laboratoires T.V.M.</td><td>03700454505621</td><td>معجون أسنان من السيليكون باللونين الأزرق والأصفر</td></tr><tr><td>Picodent twinsin speed</td><td>Rotec</td><td>13001002</td><td></td></tr><tr><td>Qtracker 655 ملصق الأوعية الدموية</td><td>Invitrogen</td><td>Q21021MP</td><td>محلول قابل للحقن</td></tr><tr><td>ماسح ضوئي رنين ، 8 أو 12 كيلو هرتز</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rompun Xylazine 2٪ fl / 25 مل</td><td>Bayer</td><td>04007221032311</td><td></td></tr><tr><td>جل</td><td></td><td></td> <td>Superglueللصق الحلقة على العظم</td></tr><tr><td>قسطرة Surflo IV - أزرق 22 جم</td><td>Terumo</td><td>SR-OX2225C1</td><td></td></tr><tr><td>Ti: ليزر نابض Saph (متماسك) (فيمتوثانية)</td><td>متماسك</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

في فيفو تصوير فوتونين لخلايا ميجاكاريوسيت وبروبليتس في نخاع عظم جمجمة الفأر

In Vivo Two-photon Imaging of Megakaryocytes and Proplatelets in the Mouse Skull Bone Marrow

يتم إنتاج الصفائح الدموية بواسطة الخلايا العملاقة ، وهي خلايا متخصصة تقع في نخاع العظام. تم وصف إمكانية تصوير الخلايا الضخمة في الوقت الحقيقي وبيئتهم الأصلية منذ أكثر من 10 سنوات وتلقي ضوءا جديدا على عملية تكوين الصفائح الدموية. تمتد الخلايا الضخمة نتوءات ممدودة ، تسمى الصفائح ، من خلال البطانة البطانية للأوعية الجيبية. تقدم هذه الورقة بروتوكولا للصورة المتزامنة في الوقت الحقيقي للخلايا الضخمة المسماة بالفلورسنت في نخاع عظم الجمجمة والأوعية الجيبية. تعتمد هذه التقنية على جراحة بسيطة تحافظ على الجمجمة سليمة للحد من ردود الفعل الالتهابية. يتم شل رأس الماوس مع حلقة لصقها على الجمجمة لمنع الحركات من التنفس.
باستخدام المجهر ثنائي الفوتون ، يمكن تصور الخلايا الضخمة لمدة تصل إلى بضع ساعات ، مما يتيح مراقبة نتوءات الخلايا واللوحات الأولية في عملية الاستطالة داخل الأوعية الجيبية. وهذا يسمح للقياس الكمي لعدة معلمات تتعلق مورفولوجيا نتوءات (العرض والطول ووجود مناطق الانقباض) وسلوك استطالة (السرعة والانتظام ، أو وجود وقفات أو مراحل التراجع). تسمح هذه التقنية أيضا بالتسجيل المتزامن للصفائح الدموية المتداولة في الأوعية الجيبية لتحديد سرعة الصفائح الدموية واتجاه تدفق الدم. هذه الطريقة مفيدة بشكل خاص لدراسة دور الجينات ذات الاهتمام في تكوين الصفائح الدموية باستخدام الفئران المعدلة وراثيا وهي أيضا قابلة للاختبار الدوائي (دراسة الآليات وتقييم الأدوية في علاج اضطرابات إنتاج الصفائح الدموية). وقد أصبح أداة لا تقدر بثمن، وخاصة لاستكمال الدراسات المختبرية كما هو معروف الآن أن في الجسم الحي وفي المختبر تشكيل البربليتليت تعتمد على آليات مختلفة. وقد ثبت، على سبيل المثال، أن هناك حاجة إلى microtubules في المختبر لاستطالة proplatelet في حد ذاتها. ومع ذلك ، في الجسم الحي، فإنها تعمل بدلا من ذلك سقالة ، ويجري تعزيز الاستطالة بشكل رئيسي من قبل قوات تدفق الدم.

باستخدام هذا البروتوكول، تم إعطاء التتبع الفلوري Qtracker-655 عن طريق الوريد لتصوير الأوعية الأنفية النخاعية في نخاع عظم الجمجمة واتجاه التدفق كما هو موضح في الأسهم(الشكل 4A، إلى اليسار). باستخدام الفئران mTmG، سجلت الصفائح الدموية eGFP-الفلورسنت أكثر من 20 ثانية في كل فرع سفينة، وتم قياس سرعتها باستخدام ImageJ وGNU أوكتاف البرمجيات (الشكل 4A،والحق). لاحظ عدم التجانس في سرعة التدفق والاتجاه. الأوعية الجيوب الأنفية الحالية تدفقات معقدة بسبب anastomoses، مع وجود ت...

نحن نصف هنا طريقة تصوير الخلايا الضخمة واللوحات في نخاع عظم الجمجمة للفئران الحية باستخدام المجهر ثنائي فوتون.

Platelets are produced by megakaryocytes, specialized cells located in the bone marrow. The possibility to image megakaryocytes in real time and their ...

تسمح هذه الطريقة بالتصور في الوقت الحقيقي للأحداث المختلفة ، التي تحدث في نخاع العظم لفأر الجمجمة ، مثل الخلايا الضخمة ، وتمديد الصفائح الدموية داخل الأوعية الجيبية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي جراحة بسيطة تحتاج إلى تقليل رد الفعل الالتهابي ، مما يسمح بتصور في الجسم الحي للأحداث في ظروف المصنع تقريبا. للبدء، نقل الماوس إلى غرفة التصوير.قم بتشغيل المجهر والكمبيوتر وإعداد المعلمات المطلوبة. مرة واحدة وقد تم تخدير الماوس تماما مكان الماوس على لوحة ساخنة، وتدفأ إلى 37 درجة مئوية للجميع التلاعب التالية، حلق الرأس والحلق من الماوس وتطبيق هلام للعيون لمنع الجفاف. ضع الماوس على ظهره وأصلح الساقين الأماميتين بشريط جراحي لتمديد الحلق.بعد تطهير الحلق، قم بإجراء شق من 0.7 إلى 1 سنتيمتر على الوريد الوداجي الأيمن أو الأيسر باستخدام مقص ومد النسيج الضام المجاور لفضح الوريد الخارجي المشعوذ فوق العضلة الصدرية. ملء القسطرة مع الحارة، والملوحة الفسيولوجية العقيمة. اختراق القسطرة من خلال العضلات الصدرية ومن ثم إدراج القسطرة في الوريد.قم بإزالة الإبرة برفق، وربط الحقنة مع التتبعات الفلورية وحقن الحجم الميت للقسطرة. ضع قطرة من الغراء الجراحي لتثبيت القسطرة. أعد الماوس بعناية إلى موضع عرضة.تطهير فروة الرأس مع 70٪ الإيثانول مع منشفة ورقية أثناء إزالة الشعر فضفاضة. استخدم مقصا وملاقط دقيقة معقمة لإجراء شق على شكل حرف T عند خط الوسط يصل إلى سنتيمتر واحد بين الأذنين على فروة الرأس لكشف الجلجلة. فضح الجمجمة مع ملاقط، ثم استخدام مقص وملاقط لإزالة البيريوستوم بعناية.استخدام مسحة القطن المعقمة غارقة والمحلول الملحي الفسيولوجية لإزالة جميع periosteum وأي حطام أو الشعر التي يمكن أن تغير التصوير. شطف الجمجمة مع المالحة لإزالة أي آثار الدم وتجفيف العظام بسرعة مع مسحة القطن. تطبيق هلام الغراء على الحلبة، ووضع الخاتم على العظام المكشوفة والحفاظ عليه لبضع ثوان للسماح للحلقة نعلق بحزم على الجمجمة.ترطيب طفيفة الجمجمة مع مسحة القطن المتشبثة المالحة. إعداد عجينة الأسنان السيليكون عن طريق خلط بعناية المكونات الزرقاء والصفراء بنسبة واحد إلى واحد. ختم الحلبة عن طريق تطبيق معجون الأسنان لمنع التسرب أثناء التصوير.إزالة بعناية أي عجينة الأسنان أو الغراء التي قد دخلت الحلبة. ثم ملء الحلبة مع المالحة للتحقق من التسرب. ضع الماوس على الدعم ووضع ضغط مطوي تحت رأس الحيوان لرفع الرأس ومنع انفصال الحلقة عن الجمجمة عند إرفاقها بالحامل.المسمار الخاتم على حامل كتلة. ضع الدعم وتجميع الماوس في غرفة المجهر الساخنة. تعيين أطوال موجية الليزر المناسبة لأربع أربع مختارة واستعادة الأضواء المنبعثة.باستخدام القسطرة بين المشعوذ حقن 50 ميكرولتر من محلول 0.2 ميكرومولار من التتبع الفلورسنت لتسمية الأوعية الدموية. وضع مرحلة المجهر مع الدعم والفأر تحت الهدف من المجهر. تأكد من أن الحلقة مليئة دائما بالمحلول الملحي وإعادة تعبئته إذا لزم الأمر ، وغمر الهدف والمالحة.استخدام epifluorescence لتحديد موقع الأوعية نخاع العظم ومراقبة الخلايا الضخمة الانحياز على طول الأوعية الجيوب الأنفية. لعمليات الاستحواذ الطويلة، قم بإعداد اكتساب 3D للزمكان مع صورة 384 في 384 بكسل باستخدام ماسح الرنين 8 كيلو هيرتز، ووضع ثنائي الاتجاه. استخدام خط المتوسط مع دقة جيدة، ثم اختيار حجم الخطوة Z الأمثل وإعداد الفاصل الزمني اللازم قبل بدء الاستحواذ.بالنسبة لعمليات الاستحواذ القصيرة والسريعة، اختر مساحة ونوع اكتساب الوقت وتقليل حجم الصورة. إذا لزم الأمر، قم بضبط الصورة على السفينة عن طريق تدوير حقل التصوير. استخدم أعلى سرعة مسح متاحة ومسح ثنائي الاتجاه.تقليل متوسط الخط للعثور على الحل الوسط الأمثل بين تعريف الصورة وسرعة الاستحواذ. احصل على خطة Z واحدة فقط وتصغير الفترة الزمنية للاستحواذ. لقياس سرعة الصفائح الدموية 10 إلى 20 ثانية من اكتساب ينبغي أن تكون كافية.تم إعطاء التتبع الفلوري عن طريق الوريد لتصوير الأوعية الأنفية النخاعية في نخاع عظم الجمجمة ، مع اتجاه التدفق الذي يصوره السهم. وسجلت سرعة الصفائح الدموية الفلورية في كل فرع من فروع السفن، ولوحظ تباين. الأوعية الجيوب الأنفية الحالية تدفقات معقدة بسبب anastomoses، مع وجود تدفق إعادة تدفق وحتى الركود.أشارت الأسهم إلى الاتجاه المعاكس للتدفق عند التشعب. كما تم قياس سرعة الصفائح الدموية لفروع السفن اليسرى واليمينية التي أشارت إلى وجود خلل بمرور الوقت في كل فرع من فروع السفن مع مراحل التسارع والركود والتباطؤ. لوحظت مورفولوجيا مختلفة من الألواح، بما في ذلك الألواح ذات الهوامش غير المنتظمة، ثم الألواح البروبليتية التي يتوقون لها والألواح السميكة والقصيرة.عندما قامت الخلايا الضخمة بتوسيع الصفائح في مناطق التدفقات المعقدة ، تم الزبربلات من فرع سفينة إلى أخرى ، وفقا لاتجاه التدفق. عند وقف تدفق الدم ، خففت الصفائح الدموية وخضع الفأر بشكل غير متوقع لسكتة قلبية ، مما يشير إلى أهمية القوى الهيدروديناميكية في استطالة الصفائح. كما تم قياس عرض وطول الألواح العريضة متوسط عرض 5.2 ميكرومتر، ولوحظ طول أقصى متوسط يبلغ حوالي 185 ميكرومتر.رسم طول البربليتليت كدالة للوقت يسمح تصور سلوك الصفائح خلال مراحل الاستطالة، ركود، أو حتى التراجع. ولوحظ أن متوسط سرعة الاستطالة يبلغ حوالي 10 ميكرومترات في الدقيقة. تركيب القسطرة، سمح حقن المخدرات لدراسة الآثار على تشكيل البروبليت أو غيرها من الأحداث ذات الأهمية في الوقت الحقيقي.

in-vivo-two-photon-imaging-megakaryocytes-proplatelets-mouse-skull

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

في هذا الفيديو ، نصف إجراء جراحيا لزرع مجموعة حلقة قحفية على عظم الجمجمة المكشوف وتثبيت رأس الفأر لتصوير الدماغ عالي الدقة لفترة طويلة.

تركيب مجموعة حلقة الجمجمة في نموذج الماوس: إجراء جراحي لزرع مجموعة نافذة التصور على جمجمة الفئران لتصوير نخاع عظم الجمجمة عالي الدقة

يوفر التصوير بفاصل زمني &lt; p class = 'jove_content'&gt; في الحي معلومات قيمة عن إعادة التنظيم الهيكلي في الدماغ السليم. هنا ، نقدم مستحضر جمجمة رقيق يسمح بالتصوير عبر الجمجمة للهياكل المشبكية المصنفة بالفلورسنت في قشرة الفأر الحي عن طريق الفحص المجهري ثنائي الفوتون.

ثنائي الفوتون<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; التصوير من العمود الفقري شجيري في اللحاء باستخدام الماوس الجمجمة ضعفت إعداد

اندماجي 5 البروتينات الفلورية وضع علامات على الخلايا الجذعية المكونة للدم والسلف تسمح في الجسم الحي تتبع النسيلي عبر مبائر واثنين من الفوتون المجهري، وتوفير نظرة ثاقبة العمارة المكونة للدم نخاع العظم خلال التجدد. هذا الأسلوب يسمح رسم الخرائط مصير غير الغازية مشفرة طيفيا من الخلايا المشتقة من HSPCs في أنسجة سليمة لفترات طويلة من الزمن بعد الزرع.

في الجسم الحي تتبع نسيلي من الخلايا الجذعية المكونة للدم والسلف تميزت خمسة البروتينات الفلورية باستخدام الميكروسكوب متحد البؤر وMultiphoton

هناك سوء فهم لطبيعة التفاعلات بين الخلايا المكونة للدم الجذعية والسلف (HSPCs) ومحاريب نخاع العظام. التعديلات الأجهزة المخصصة وبروتوكول اكتساب متعددة الخطوات تسمح باستخدام اثنين من الفوتون والفحص المجهري متحد البؤر لصورة فيفو السابقين HSPCs المسمى المخزن داخل المناطق نخاع العظام، وتتبع التفاعلات والحركة.

في فيفو تتبع 4 الأبعاد للالجذعية المكونة للدم والسلف الكبار في خلايا الفأر قبي نخاع العظم

الخلايا الوحيدة هي المنظمين الرئيسيين للمناعة الفطرية وتلعب دورا مهما في تجديد نظام البلعمة أحادي النواة المحيطي وفي حالة الالتهاب. تصف هذه المخطوطة إجراء التصوير في الوقت الفعلي لنخاع عظم كالفاريا للفأر لدراسة آلية تعبئة الخلايا الوحيدة.

تتبع الماوس نخاع العظم وحيدات<em&gt; في فيفو</em

نقوم بتفصيل بروتوكول لمراقبة سلوك العدلات والخلايا الوحيدة في الأوردة المساريقية في ظل الحالة المستقرة والظروف الالتهابية باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر داخل الحيوية على الفئران المخدرة.

التصوير العدلات وحيدات في مساريقي الأوردة التي كتبها حيوي داخلي المجهري على الفئران مخدرة في الوقت الحقيقي

يصف البروتوكول نموذجا جديدا لغرفة نافذة عظم الفخذ الفئران يمكن استخدامه لتتبع حركة الخلايا في نخاع عظم الفخذ في الجسم الحي. يستخدم الفحص المجهري الفلوري متعدد الفوتون داخل الحيوية لتصوير ثلاثة مكونات لنخاع عظم الفخذ (الأوعية الدموية ومصفوفة الكولاجين والعدلات) بمرور الوقت.

عظم الفخذ نافذة الغرفة نموذج ل<em&gt; في فيفو</em&gt; تتبع الخلايا في الفئران نخاع العظام

يتم تطبيق مجهرية الأسفار إينترافيتال (إيففم) كالفاريوم في تركيبة مع الوراثية نماذج حيوانية لدراسة صاروخ موجه وانجرافتمينت من الخلايا المكونة للدم في نخاع العظم (بي أم) منافذ.

الجمع بين الفحص المجهري نيون إينترافيتال (إيففم) مع النماذج الوراثية لدراسة ديناميات Engraftment الخلايا المكونة للدم لمنافذ نخاع العظام

هنا، نقدم بروتوكولا لتحليل البنية الفوقية للخلايا العملاقة في الموقع باستخدام المجهر الإلكتروني الإرسال (TEM). يتم جمع نخاع عظم مورين، ثابتة، جزءا لا يتجزأ من راتنج الايبوكسي وقطع في أقسام ultrathin. بعد تلطيخ التباين ، لوحظ نخاع العظم تحت مجهر TEM عند 120 كيلو فولت.

في سيتو استكشاف مورين ميغاكاريوبويز باستخدام المجهر الإلكتروني انتقال

هنا، ونحن بالتفصيل طريقة explant نخاع العظم، من إعداد العينة لتحليل الشريحة المجهرية، لتقييم قدرة megakaryocytes التي تمايزت في بيئتها الفسيولوجية لتشكيل الصفائح.

ديناميات تشكيل الصفائح الدموية من الفأر نخاع العظم الطازج Explants

يسمح الفحص المجهري داخل الحيوية بدراسة العمليات البيولوجية الديناميكية مثل تجديد الأنسجة وتطور الورم. يقدم نخاع العظم الجلفي ، وهو نسيج ديناميكي للغاية ، نظرة ثاقبة حول تكون الدم ووظيفة الأوعية الدموية. يسمح استخدام غرسة تثبيت الرأس المطبوعة ثلاثية الأبعاد المتوافقة حيويا بالتصوير الطولي المتكرر ، مما يعزز فهمنا لديناميكيات الأنسجة والبيئة الدقيقة للورم.

التصوير الطولي داخل الحيوية لديناميكيات الأوعية الدموية في نخاع عظم الجلسنة

تعلم تصوير خلايا ميجاكاريوسيت وبروبليتس في نخاع عظم جمجمة الفأر باستخدام المجهر ثنائي الفوتون. تتيح هذه الطريقة دراسة تكوين الصفائح الدموية في الظروف الفسيولوجية الحقيقية.

في فيفو تصوير فوتونين لخلايا ميجاكاريوسيت وبروبليتس في نخاع عظم جمجمة الفأر

استكشف المزيد من الفيديوهات