التقاط المركبات العضوية المتطايرة الميكروبية المنتجة بنشاط من العينات المرتبطة بالإنسان باستخدام استخراج المواد الماصة بمساعدة الفراغ

يسمح لنا هذا البروتوكول بالتركيز بسهولة وتحديد المستقلبات المتطايرة والمتطايرة المنتجة بنشاط من الكائنات الحية الميكروبية في مجموعة متنوعة من العينات البيولوجية. VASE هي طريقة أكثر سهولة في الاستخدام لتركيز المواد المتطايرة منخفضة الوفرة. كل ما تحتاجه هو عينة تحت الفراغ القريب ، ودع الفيزياء تقوم بالباقي.

إن الوصول إلى التحليل المتطاير للعينات السريرية له آثار مهمة على اكتشاف المؤشرات الحيوية الأيضية في عدد من الحالات المرضية المختلفة. على سبيل المثال ، يمكن الكشف عن قيادة مسببات الأمراض والعدوى أو نجاح العلاج المضاد للبكتيريا من خلال التحليل المتطاير لعينات اللعاب أو البلغم أو التنفس. لإعداد عينات من البراز ، أضف ملليلتر واحد من الماء منزوع الأيونات إلى 100 ملليغرام من البراز في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر ودوامة لمدة ثلاث دقائق.

احتفظ بالعينات على الجليد عندما لا تكون قيد الاستخدام. أضف 485 ملليلتر من وسط BHI مع جلوكوز 20 ملليمول 13C أو BHI مع 30٪ ديوتيريوم إلى 15 ميكرولتر من خليط البراز والماء ، مما يضمن أن الحجم النهائي للعينة هو 500 ميكرولتر. إعداد عينات في ثلاثة أضعاف التقنية.

لإعداد عينات من مياه الصرف الصحي ، أضف 500 ميكرولتر من مياه الصرف الصحي إلى 500 ميكرولتر من وسط BHI مع جلوكوز 13C أو 30٪ ديوتيريوم لحجم إجمالي قدره ملليلتر واحد. تحضير العينات في ثلاثة أضعاف والاحتفاظ بها على الجليد. لإعداد عينات اللعاب ، أضف 50 ميكرولتر من اللعاب إلى 500 ميكرولتر من وسط BHI مع جلوكوز 13C أو 30٪ ديوتيريوم لحجم إجمالي قدره 550 ميكرولتر.

تحضير العينات في ثلاثة أضعاف والاحتفاظ بها على الجليد. لإعداد عينات البلغم ، أضف 15 ميكرولتر من البلغم إلى قارورة. تحضير العينات في ثلاثة أضعاف والاحتفاظ بها على الجليد.

ضع قوارير VOA فارغة على اللوحة الباردة وضع الصفيحة الباردة على الجليد في غطاء السلامة الأحيائية. قم بتشغيل 5600 SPEU واضبطه على درجة الحرارة المطلوبة. قم بتسمية قوارير VOA سعة 20 ملليلتر وفقا للعينات والنسخ المتماثلة ومعرفات HSP باستخدام علامة مقاومة للماء تقاوم الماء في حالة تشكل التكثيف على الأجزاء الخارجية من القارورة أثناء وجودها على الجليد.

داخل غطاء السلامة الأحيائية ، قم بفك الغطاء الأبيض على القارورة ، وقم بسحب العينة بسرعة في القارورة ، وقم بتجميع بطانة الغطاء والغطاء الأسود و HSP. ضع القارورة التي تحتوي على العينة و HSP مرة أخرى على اللوحة الباردة. بمجرد إعداد جميع العينات في القوارير الزجاجية ، قم بتشغيل مضخة التفريغ ، وضع القوارير تحت الفراغ ، وإزالة مصدر الفراغ.

تحقق مرة أخرى من الضغط بعد وضع جميع العينات تحت الفراغ باستخدام مقياس الضغط. إذا كانت القارورة تتسرب ، فتأكد من أن الغطاء مشدود بإحكام وأن حلقات O البيضاء لبطانات HSP والغطاء في مكانها بشكل صحيح. ضع القوارير في SPEU للحصول على الوقت ودرجة الحرارة الأمثل مع الإثارة عند 200 دورة في الدقيقة.

استخراج الثقافات لمدة ساعة واحدة عند 70 درجة مئوية واستخراج تجارب فحص النمط المتماثل المستقرة مع عينات البراز والصرف الصحي واللعاب والبلغم لمدة 18 ساعة عند 37 درجة مئوية. ضع الصفيحة الباردة عند 80 درجة مئوية تحت الصفر لاستخدامها بعد اكتمال فترة الاستخراج. عند اكتمال الاستخراج ، ضع عينات على اللوحة الباردة لمدة 15 دقيقة لسحب بخار الماء من HSP ومساحة رأس القارورة ، ثم انقل HSPs إلى أكمامها.

قم بإعداد تسلسل العينات على برنامج Entech. افتح البرنامج وحدد 5800 والتسلسل في الخيارات الموجودة على يمين القائمة المنسدلة أداة. احفظ جدول التسلسل، وحدد تشغيل على الجانب الأيمن، ثم ابدأ بفارغ في Desorber إذا لم يكن HSP الفارغ هو desorber.

لاحظ أنه سيتم التعامل مع HSPs بواسطة SPR لكل عينة في التسلسل. دع SPR يسخن. السماح ل SPR بتشغيل كافة العينات تلقائيا.

سيقوم التسلسل الموجود على جانب GC-MS بتسجيل البيانات تلقائيا في ملفات منفصلة. أضف ذروة إلى طريقة المعالجة عن طريق تحديد معايرة متبوعة بتحرير مركب واسم وإدراج مركب ضمن مركب قياسي خارجي. أضف اسم المركبات ووقت الاحتفاظ وأيون هدف الإشارة الكمية.

أضف أكبر ثلاث قمم ، والتي تشمل المركبات ذات الاحتمال الأكبر من 75٪ ، مما يضمن أن محاذاة كل أيون تعريف للمركب تقع داخل مركز الذروة. احفظه عن طريق تحديد موافق ، متبوعا بالطريقة والحفظ. بمجرد إعداد طريقة العملية، انتقل إلى القياس الكمي والحساب، ثم عرض النتيجة الكمية وQEDIT لتحديد كمية البيانات.

هنا ، أعقب استخراج المواد الماصة بمساعدة الفراغ امتزاز حراري على GC-MS لمسح الملامح المتطايرة للمزارع البكتيرية الأحادية والمشتركة ، وتحديد المواد المتطايرة المنتجة بنشاط مع فحص النظائر المستقرة من البراز البشري واللعاب ومياه الصرف الصحي وعينات البلغم. تألفت الثقافات الأحادية والمشتركة من الأنواع البكتيرية المكورات العنقودية الذهبية ، والزائفة الزنجارية ، و acinetobacter baumannii. تم الكشف عن 43 جزيئا متطايرا مشروحا من الثقافات الأحادية والمشتركة في نقاط زمنية مدتها 24 و 48 ساعة.

كان هناك المزيد من دمج 13C في جزيئات متطايرة تحمل علامات كاملة مقارنة بالديوتيريوم. تم دمج 13C في 2-butanone و 3-hydroxy و 2 و 3-butanedione diacetyl وحمض الخليك والفينول لجميع عينات البراز ومياه الصرف الصحي واللعاب. تم الكشف عن الأسيتون وحمض البيوتانويك وحمض البروبانويك على أنها موسومة في اللعاب ومياه الصرف الصحي.

في حين تم إثراء ثنائي ميثيل ثلاثي كبريتيد وثنائي كبريتيد ثنائي ميثيل في كل من عينات البراز واللعاب. تم إثراء المواد المتطايرة 1-بروبانول ، 2-بيوتانون ، بنزوفينون ، الإيثانول ، وخلات ميثيل ثيول فقط في مياه الصرف الصحي و 2 ، 3-بنتانيديون في اللعاب. تم دمج الديوتيريوم في حمض الخليك المتطاير ، البنزالدهيد ، 4-methyl-dimethyl trisulfide ، والفينول من عينات اللعاب أو مياه الصرف الصحي.

كان حمض الخليك وثنائي ميثيل ثلاثي الكبريتيد والأسيتون والبروبانول 2-ميثيل أكثر وفرة في عينات البلغم المستزرع من عينات البلغم غير المستزرعة. تم إجراء تحليل متغير متعدد المتغيرات للمتغيرات ، وهو PERMANOVA ، على مصفوفة مسافة Bray-Curtis للوفرة المتطايرة من عينات البلغم التليف الكيسي. وجدنا أن الشخص الذي تبرع بالعينة يفسر 51٪ من التباين في البلغم المستزرع المسمى 13C و 33٪ من التباين في البلغم غير المستزرع.

هنا ، يظهر نجاح وضع العلامات على النظائر المستقرة مع الجلوكوز 13C في المواد المتطايرة من عينات البلغم المستزرعة التي تم جمعها من سبعة أشخاص يعانون من التليف الكيسي. تظهر المواد المتطايرة التي لديها دمج أعلى 13C لغالبية العينات في اللوحة 5A ، وتلك التي تحتوي على نسبة أقل من 13C في غالبية عينات البلغم موجودة في اللوحة 5B ، وتظهر الجزيئات ذات التحويل الأقل بنسبة 13C في أقلية من عينات البلغم في اللوحة 5C. تحقق دائما من ضغوط القارورة بعد حوالي دقيقة.

الفراغ المكسور يهزم حساسية وسرعة طريقة VASE. بعد هذا الإجراء ، إذا تم إجراء فحص النظائر المستقرة ، يمكن استخراج الحمض النووي من المادة المتبقية لتحديد الكائنات الحية الميكروبية أو الأنواع التي قد تكون ساهمت في إنتاج الجزيئات المتطايرة. هذه الطريقة مفيدة أيضا في الكشف عن المواد المتطايرة من أي نوع عينة دون فحص النظائر.

مع مزايا الحساسية وانخفاض حجم العينة ، يمكن للعديد من التطبيقات الاستفادة من هذه التقنية.