تطبيق التداخل CRISPR (CRISPRi) لإسكات الجينات في الأنواع المسببة للأمراض من Leptospira

اسمي جارلاث نالي، وأنا جزء من فريق البحث هنا في المركز الوطني لأمراض الحيوان في أميس، أيوا، ونحن نعمل على داء اللبتوسبيروس. داء اللبتوسبيروسيس مرض مهمل. إنه مرض عالمي.

وحقا، لدينا فهم محدود جدا لكيفية هذه المجموعة الفريدة من البكتيريا تسبب العدوى. لذا فإن عرض اليوم يتعلق بتقديم نظرة عامة على أداة جديدة متاحة لتسهيل تقييم الآليات المسببة للأمراض لداء اللبتوسبيروسيس من خلال إسكات جينات محددة عبر عنها اللبتوسبيرا على وجه التحديد ، باستخدام تقنية تسمى تدخل CRISPR. ومع ذلك ، فإن القدرة على اختيار مستعمرات نيوتن تعتمد بشكل كبير على توفير أفضل وسائل الإعلام للنمو لهذه اللبتوسبيرا السريعة.

لذا، أولا وقبل كل شيء، نحن ستعمل أعرض لكم لريك هورنسبي، الذي كان يقدم لفترة وجيزة جدا وسائل الإعلام الجديدة لنشر هذه البكتيريا سريع. وبعد ذلك سنقدمك إلى لويس فرنانديز، الذي سيتحدث عن منهجية تدخل CRISPR لإسكات الجينات المستهدفة داخل اللبتوسبيرا. مرحبا، أنا ريك هورنسبي.

منذ التعرف عليها من قبل أنادا قبل أكثر من 100 سنة، تم عادة عزل اللبتوسبيرا ونشرها عند 29 درجة مئوية، وهي درجة حرارة لا تعكس البيئة ولا درجة حرارة الجسم المضيف للثدييات. قبل 10 سنوات ، بدأت وزارة الزراعة الأمريكية ERS البحث في التحسينات على وسائل الإعلام leptospira ومن هذا البحث ، تم تطوير Hornsby-Alt-Nally media. وباستخدام هذه الوسائط، تمكن الأطباء والباحثون من عزل ونشر اللبتوسبيرا بسرعة أكبر من الحالات الميدانية وفي البحوث المختبرية في درجة حرارة وفي بيئة تحاكي بشكل أوثق مضيف الثدييات.

ونحن نواصل تحسين هذه الوسائط، ولكن كما هو الحال الآن، أظهرت هان القدرة على تحسين كبير في العزلات البيطرية والبشرية السريرية في البحوث المختبرية وتطوير لقاحات أكثر فعالية للوقاية من داء اللبتوسبيروسيس. مرحبا، أنا لويس فرنانديز. حتى الآن، ظلت الإمراض من داء اللبتوسبيروسيس غير مستكشفة، ويرجع ذلك أساسا إلى عدم وجود أنابيب جينية فعالة وسهلة الأداء.

هنا نحن ذاهبون لوصف تقنية جديدة تسمى كريسبر التدخل أو CRISPRi. وهذه التقنية بسيطة جدا لأننا نحتاج فقط للتعبير عن مكونين، بروتين واحد ملزم للحمض النووي يسمى Cas9 الميت، أو dCas9، وجزيئ الحمض النووي الريبي الشيمي يسمى الحمض النووي الريبي أحادي الدليل. وdCas9 المعقدة ودليل الجيش الملكي النيبالي سوف تجعل قاعدة الاقتران إلى الجين المستهدف لدينا، وبالتالي تقليل أو حتى منع النسخ.

أيضا باستخدام وسائل الإعلام هان وصفها حديثا، يمكننا أن تقلل بشكل كبير وقت تشكيل مستعمرة لانتعاش متحولة. الخطوة الأولى هي تحديد protospacer التي سيتم تضمينها في دليل الجيش الملكي النيبالي. ويتألف هذا التسلسل من 20 نواة ستحدد الاقتران الأساسي بالأهداف الجينية المرغوبة.

تقديم تسلسل النيوكليوتيدات إلى CHOPCHOP خادم الويب، مع المعلمات المحددة لpyogenes العقدية، Cas9، وبروتوسبيسر عزر المجاورة، NGG. استنادا إلى النتائج، حدد protospacers مع أفضل الدرجات ضمن الاتجاه ناقص. لن يتم تضمين عزر NGG في التسلسل النهائي.

لقد تم استخدام المروج lipL32 للتعبير عن الحمض النووي الريبي دليل واحد، والتي سوف تحتوي على متغير 20 النيوكليوتيدات في خمسة رئيس الوزراء في سقالة dCas9 المحفوظة. بعد الحصول على كاسيت سيتم إنزاله إلى PMaOri. dCas9 البلازميد في موقع تقييد Xma1.

لخلايا اللبتوسبيرا اقتران تزرع في 29 أو 37 درجة مئوية في وسائل الإعلام هان. قبل يوم واحد من اقتران, تزرع الخلايا المانحة تعادل في وسائل الإعلام LB تكملها حمض ديامينوبيميليك, DAP, وspectinomycin. بعد ذلك ، في يوم شواء التواز ، تشبع ثقافات الإشريكية القولونية في LB بالإضافة إلى DAP.

داخل غطاء الأمان الحيوي ، تجميع جهاز الترشيح عن طريق وضع فلتر الغشاء على رأس القاعدة الزجاجية ، يليه قمع زجاجي 15 مل. وتعقد كل قطعة معا من قبل هذا المشبك الربيع. ثم ربط الزجاج إلى مضخة فراغ، إضافة خمسة مل من الثقافات leptospira إلى القمع.

بعد ذلك ، أضف سلالة E.Coli beta 2163 التي تحتوي على البلازميد المثير للاهتمام. سيختلف الحجم وفقا للكثافة البصرية للثقافة. نحن نهدف إلى الأنابيب الخلية واحد إلى واحد.

بدوره مضخة فراغ، والآن السوائل سوف نصل من خلال الغشاء والخلايا سوف تتركز على أعلى من ذلك. خذ الفلتر وضعه على لوحة EMJH بالإضافة إلى DAP ، الجانب bicurier لأعلى. احتضان لوحات في 29 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.

ثم استرداد المرشحات من لوحات ووضعه في أنبوب مخروطي 50 مل. استخدام واحد مل من وسائل الإعلام هان السائل لاستعادة الخلايا من مرشح عن طريق pipetting. تصور الخلايا المستردة عن طريق المجهر حقل الظلام.

في هذه المرحلة يمكن رؤية أعداد مكافئة من الإشريكية القولونية واللبتوسبيرا. وتستخدم 100 إلى 200 ميكرولتر لنشر البكتيريا على لوحات هان التي تحتوي على spectinomycin. في هذه المرحلة، يتم حذف DAP ولن تنمو الإشريكية القولونية.

يتم احتضان لوحات في 37 درجة مئوية و 3٪ CO2. يجب أن تكون المستعمرات واضحة بين ثمانية إلى عشرة أيام. مستعمرات اللبتوسبيرا بين القرون صعبة بعض الشيء لتصورها.

هنا نعرض مستعمرات متضخمة لتسهيل رؤيتها. إضافة 100 ميكرولتر من هان السائل، إلى أنابيب 1.5 مل لاستعادة المسوخ. فمن المستحسن أن تأخذ ما لا يقل عن ثلاث مستعمرات من كل لوحة.

باستخدام طرف ماصة، سيتم استرداد المستعمرات الفردية من لوحات. من المتوقع أن يؤخذ (أغر) وحيدا يجب أخذ المستعمرات من لوحات التحكم التي تحتوي على MTP PMaOri.

dCas9 بلازميد. ولوحات مع leptospiras التي تحتوي على البلازميد مع كل من dCas9 ودليل الجيش الملكي النيبالي مصممة للجين الهدف. ويمكن الآن تصور الخلايا المستردة تحت المجهر الحقل المظلم لتأكيد وجود leptospiras ترك قابلة للحياة.

بعد التصور من ترك leptospiras، نقل الخلايا إلى وسائل الإعلام هان السائلة التي تحتوي على spectinomycin. بعد نمو الثقافة، يمكن الآن استعادة الخلايا لإسكات تأكيد والتقييم الظاهري. إذا كانت الأجسام المضادة ضد البروتينات المستهدفة متاحة immunoblot هو منهجية مباشرة إلى الأمام لتقييم إسكات.

اللبتوسبيرا التي تحتوي على pMAOri. dCas9 وحدها، أو مع دليل RNA Cas يتم تقييمها بواسطة PCR، الخشب يحيط التمهيديات. DMT plasmid سيؤدي إلى عصابة من ما يقرب من 300 زوج قاعدة ويتم تحقيق نوع واحد فقط من حوالي 700 عندما يكون شريط الحمض النووي الريبي دليل موجود.

يتم تنفيذ المناعي باستخدام مقتطفات الخلايا الكاملة لتأكيد إسكات, يتم إلغاء التعبير البروتين lipL32 في الخلايا التي تحتوي على البلازميدات أعرب في dCas9 ودليل الجيش الملكي النيبالي استهداف هذا الجين. وكلا الارتباطين A والارتباط B غائبان في الخلايا التي تحتوي على الحمض النووي الريبي الدليلي ، وهو محدد لكلا الجينين. يمكن رؤية lipL41 التحكم في جميع الممرات.

لذلك استخدمنا تدخل CRISPR على اللولبية بين الأجناس ، كما استخدمناه على العديد من الأنواع المسببة للأمراض الإضافية من اللبتوسبيرا. لقد استخدمناه لإسكات جينات محددة ، وكذلك إسكات التعبير عن RNAs صغيرة غير الترميز. اهتمامنا البحثي هو في فهم الآليات المسببة للأمراض للعدوى، لذلك نحن نتطلع عادة إلى تحديد عوامل التباين، ولكن من الواضح أنه يمكنك إسكات الجين الخاص بك من اختيارك ووفقا لمنطقتك الخاصة من البحوث.

وعلى سبيل المثال، قد يكون ذلك حركية أو فهم كيف تستمر اللبتوسبيرا في البيئة، أو التمثيل الغذائي. على أي حال، يجب أن تكون قادرة على توليد متحولة محددة من شأنها أن تسمح لك لأداء الجينوم وظيفية وفهم الأهمية البيولوجية للجين في السؤال. لذا منا جميعا هنا في المركز الوطني لأمراض الحيوان، نتمنى لكم كل التوفيق في أبحاثكم.