التنميط المكاني للبروتين وتعبير الحمض النووي الريبي في الأنسجة: نهج لضبط التشريح المجهري الافتراضي

يساعد هذا البروتوكول في توجيه اختيار المناطق ذات الأهمية لتقنيات omics المكانية ، مما يسمح بتوصيف أكثر استهدافا للأنسجة أو مجموعات الخلايا. يعد البروتوكول الآلي لاختيار عائد الاستثمار في فحوصات البروتينات أكثر قوة وقابلية للتكرار من البروتوكولات اليدوية ، واستخدام عائد استثمار 50 ميكرومتر لفحوصات النسخ يسمح بتنميط مجموعات خلايا معينة. ابدأ ببرمجة جهاز التلوين التلقائي لتطبيق الأجسام المضادة للتصور الفلوري.

في برنامج autostainer ، انقر فوق زر الصفحة الرئيسية واختر البروتوكولات. ثم انقر فوق إنشاء / تحرير البروتوكولات وحدد RUO Discovery Universal كإجراء. انقر فوق التسلسل الأول ، ثم حدد Deparaffinazation ، متبوعا ب Depar v2.

بالنسبة لدرجة الحرارة المتوسطة ، اختر 72 درجة مئوية ، ثم انقر فوق المعالجة المسبقة وحدد تكييف الخلية وخزان CC1. للحصول على درجة حرارة عالية جدا ، اختر 100 درجة مئوية ، ثم انقر فوق CC1 ثماني دقائق ، واستمر في النقر حتى يتم تحديد CC1 64 دقيقة. انقر فوق المانع ، ثم حدد DISCOVERY Inhibitor ، وبالنسبة لوقت الحضانة ، اختر ثماني دقائق.

ثم انقر فوق الأجسام المضادة ، متبوعا بحضانة الأجسام المضادة عالية الحرارة. لدرجة حرارة منخفضة ، اختر 37 درجة مئوية. بالنسبة للجسم المضاد ، اختر ANTIBODY 6 من ملصق الموزع.

لوقت الحضانة الزائد، حدد 32 دقيقة. انقر فوق Multimer HRP ، ثم حدد Multimer HRP Blocker. ثم لحظر الأجسام المضادة ، اختر gt ig block.

ولوقت الحضانة ، اختر أربع دقائق. بعد ذلك ، في كاشف Multimer HRP ، حدد OMap Anti-Rb HRP ، ولوقت الحضانة ، اختر 16 دقيقة. ثم انقر فوق Cy5 ، ولوقت الحضانة الطويل ، اختر ساعة الصفر وثماني دقائق.

انقر فوق التسلسل المزدوج واختر تمسخ الأجسام المضادة. ثم حدد تشوه الجسم المضاد CC2-1 ، وللحصول على درجة حرارة عالية جدا ، اختر 100 درجة مئوية. تأكد من أن وقت الحضانة ثماني دقائق.

بعد ذلك ، انقر فوق DS Inhibitor وحدد تحييد. انقر فوق DS Antibody ، وللحصول على درجة حرارة منخفضة جدا ، اختر 37 درجة مئوية. ثم في الأجسام المضادة ، اختر ANTIBODY 3 من ملصق الموزع.

ولوقت الحضانة الزائد، حدد 32 دقيقة. انقر فوق DS Multimer HRP واختر DS Multimer HRP Blocker. ثم بالنسبة لحظر الأجسام المضادة ، حدد Gt Ig Block ، ولوقت الحضانة ، اختر أربع دقائق.

بعد ذلك ، في كاشف Multimer HRP ، حدد OMap anti-Ms HRP ، ولوقت الحضانة ، اختر 16 دقيقة. ثم انقر فوق DS Rhodamine 6G ، ولوقت الحضانة الطويل ، اختر ساعة الصفر وثماني دقائق. انقر فوق Triple Stain وحدد TS Antibody Denaturation ، ثم حدد تشوه الأجسام المضادة CC2-2 ، ولدرجة الحرارة العالية جدا ، حدد 100 درجة مئوية.

تأكد من أن وقت الحضانة ثماني دقائق. بعد ذلك ، انقر فوق مثبط TS وحدد تحييد TS. انقر فوق TS Antibody ، وللحصول على درجة حرارة منخفضة جدا ، حدد 37 درجة مئوية.

ثم في Antibody ، حدد ANTIBODY 7 من ملصق الموزع ، وبالنسبة ل Plus Incubation Time ، حدد 32 دقيقة. انقر فوق TS Multimer HRP واختر مانع TS Multimer HRP. ثم بالنسبة لحظر الأجسام المضادة ، حدد Gt Ig Block ، ولوقت الحضانة ، اختر أربع دقائق.

بعد ذلك في كاشف Multimer HRP ، حدد OMap Anti-Rb HRP ، ولوقت الحضانة ، اختر 16 دقيقة. ثم انقر فوق TS FAM ، ولوقت الحضانة الطويل ، اختر ساعة الصفر وثماني دقائق. انقر فوق حفظ وأضف عنوانا إلى البروتوكول.

حدد رقم بروتوكول ، وأضف تعليقا ، وانقر فوق نشط ، متبوعا بحفظ. اخبز أقسام الأنسجة البشرية المثبتة بالبارافين المثبتة بالفورمالين التي اشتراها البائع في فرن مضبوط على 70 درجة مئوية لمدة 20 إلى 60 دقيقة. أثناء خبز الشرائح، اطبع الملصقات بالنقر فوق إنشاء ملصق في برنامج التلوين التلقائي.

بعد ذلك ، انقر فوق البروتوكولات ، وحدد رقم البروتوكول وانقر فوق إغلاق / طباعة. أضف المعلومات ذات الصلة على ملصق الشريحة وانقر فوق طباعة. أخرج الشرائح من الفرن واتركها تبرد إلى درجة حرارة الغرفة.

قم بتطبيق تسميات البروتوكول المطبوعة مسبقا على الشرائح المقابلة. قم بتحميل موزعات الأجسام المضادة القابلة لإعادة التعبئة بالأجسام المضادة وفقا لأرقام ملصق الأجسام المضادة. قم بتخفيف كل جسم مضاد في المادة المخففة المحددة وقم بتجهيز موزعات الأجسام المضادة القابلة لإعادة التعبئة.

اجمع موزعات الكواشف المعبأة مسبقا للحجب والكشف والتضخيم وضعها على درج كاشف الجهاز. قم بتحميل الشرائح في أدراج الشرائح وانقر فوق تشغيل ، متبوعا ب نعم. قم بتأكيد بدء التشغيل عن طريق التحقق من مدة التشغيل على برنامج autostainer.

في اليوم التالي ، تأكد من اكتمال التشغيل من خلال مراقبة الأضواء الوامضة الخضراء على فتحات درج الشريحة. ثم أخرج الشرائح من الجهاز واشطف الشرائح بقوة في مخزن تفاعل 1x حتى تتم إزالة محلول انزلاق الغطاء السائل تماما. استبدل SYTO 13 ب SYTO 64 عند 5،000 نانومولار لتمكين تكامل الفلوروفور.

تمييع SYTO 64 في 1x TBS واحتضانها في غرفة الرطوبة لمدة 15 دقيقة. استخدم FITC ل DISCOVERY Fam واضبط التعرض على 200 مللي ثانية. استخدم Cy3 ل DISCOVERY Rhodamine 6G واضبط التعرض على 200 مللي ثانية.

استخدم Texas Red ل SYTO 64 واضبط التعرض على 50 مللي ثانية. حدد SYTO 64 كقناة التركيز ، وأخيرا ، استخدم Cy5 ل DISCOVERY Cy5. اضبط التعرض على 200 مللي ثانية واحفظ التغييرات.

اخبز أقسام حبيبات الخلايا المثبتة بالبارافين في فرن مضبوط على 70 درجة مئوية لمدة 20 إلى 60 دقيقة. مسح الشرائح على منصة التنميط المكاني وتحديد أحجام 50 ميكرومتر و 300 ميكرومتر. تم تطوير بروتوكول التصور الآلي من خلال تضمين عناصر تحكم ترك واحدة للتأكد من عدم وجود نزيف من القنوات المجاورة.

تظهر خريطة الحرارة log 2 لجميع العلامات المضمنة في مقايسة البروتينات المكانية التي تقارن بروتوكول Pan-cytokeratin CD 45 اليدوي باللون الأسود ببروتوكول 3-plex الآلي باللون الرمادي قيمة Spearman R تبلغ 0.88. من بين 31 جسما مضادا مستخدما في المقايسات ، كان ل 23 جسما مضادا قيمة Spearman R أعلى من أو تساوي 0.5. أظهرت خريطة الحرارة log 2 للأهداف المختارة المدرجة في مقايسة النسخ المكاني التي تقارن بروتوكول Pan-cytokeratin CD 45 اليدوي باللون الأسود بالبروتوكول الآلي 3-plex باللون الرمادي اختلافات في هذه القيم.

قدمت بيانات التسلسل لبروتوكول التصور الآلي 3-plex قيما أقل عند مقارنتها ببروتوكول التصور اليدوي ل pan-cytokeratin CD 45 ، والذي ينعكس أيضا في قيم Spearman R المنخفضة البالغة 0.15. أيضا ، لوحظ فقدان النطاق الديناميكي عند استخدام البروتوكول الآلي للتصور 3-plex. تم الكشف عن عائد الاستثمار الصغير في بروتوكول النسخ المكاني عن طريق اختيار مناطق دائرية ذات أهمية عند 50 ميكرومتر و 300 ميكرومتر قطر عدد الحمض النووي الريبي لأهداف مختارة على خطوط خلايا مختلفة كانت قابلة للمقارنة بين منطقتي أحجام الاهتمام بعد التطبيع.

يمكن للباحثين تكييف هذا البروتوكول للوحات التصور الآلي من خلال تبادل العلامات من أجل تطوير لوحات تحدد بدقة عائد الاستثمار للإجابة على أسئلة البروتينات المكانية الخاصة بهم.