تقييم ضعف المحرك في نماذج C. elegans من التصلب الجانبي الضموري

بروتوكولنا يقدم اثنين من المقايسات، تحديد حركة C.elegans. تقيم هذه الطرق الأنماط الظاهرية الحركية مثل تلك التي تعرضها نماذج التصلب الجانبي الضموري، أو ALS. إن اختبار الحركة الشعاعية هو طريقة فعالة من حيث التكلفة وسهلة للكشف عن الزحف على سطح صلب.

يستخدم اختبار السباحة التتبع القائم على الكمبيوتر للكشف غير المتحيز عن حركات الضرب في السائل. هذه الأساليب مفيدة لتحديد فروق الحركة في C.elegans. على الرغم من أننا ندرس ALS، فإنها يمكن أن تستخدم لأي سلالة مع تغيير الحركة.

اقلب لوحات المقايسة NGM رأسا على عقب. وتسمية الجزء السفلي مع معرف لسلالات C.elegans ليتم فحصها. جعل نقطة صغيرة مع علامة في وسط لوحة رأسا على عقب.

أثناء العمل مع المجهر تشريح، نقل الديدان إلى وسط لوحة المقايسة. و تعيين جهاز توقيت لمدة 30 دقيقة. ضعي الغطاء مرة أخرى على الطبق وضعيه جانبا.

استمر في نقل الديدان حتى تكون جميع السلالات على لوحات الفحص المعينة. بعد 30 دقيقة، ابدأ بتسجيل أول لوحة عن طريق إزالة الغطاء ووضع وجه اللوحة لأسفل تحت المجهر التشريحي. ضبط المجهر التركيز حتى تكون جميع الديدان مرئية من خلال أوجر.

باستخدام قلم تلميح ملون مختلف من نقطة الوسط ، ضع نقطة صغيرة في موقع كل دودة. تحقق من حافة لوحة وبعض الديدان قد ينتهي هناك. أيضا، عد وسجل عدد الديدان لم تتحرك من نقطة الوسط.

قياس المسافة من نقطة الوسط إلى علامات الموقع النهائي لكل دودة، وتسجيل المسافة باستخدام مسطرة. تم وضع علامة على نقطة الفيروس المتنقل الأولى مع اندفاعة. سجل بيانات الطول لكل نقطة على التوالي عن طريق تدوير اللوحة بطريقة عقارب الساعة.

افتح البرنامج المقترن لإعداد وتسجيل مقاطع الفيديو. انقر فوق رمز التقاط الفيديو. اضغط لأسفل على مقبض باهتة وتحويلها في اتجاه عقارب الساعة لضبط الضوء.

في نافذة التقاط الفيديو، انقر على علامة التبويب إعدادات وضبط وضع الفيديو إلى 2456x2052_Mono8، معدل الإطار إلى 14، والإخراج أحادية اللون. التعرض من 0.00300 ثانية. كسب إلى 1 ديسيبل.

غاما إلى واحد. وتدوير إلى 180. العودة إلى علامة التبويب التقاط، حدد مجلد التسجيل وتعيين اسم ملف عن طريق إدخاله في مربع النص بادئة الملف.

تعيين إعدادات التقاط أخرى مثل المخزن المؤقت، إلى 128 إطار ومدة دقيقة واحدة. ضع لوحة المقايسة مضاءة على خشبة مسرح الجهاز وتمركزها في شاشة التقاط الفيديو، ثم قم بإزالة الغطاء. استخدام micropipette لغسل حوالي 50 الديدان في 1 مل من M9 على لوحة المقايسة.

دوامة بلطف لوحة لجلب الحيوانات إلى المركز، أو استخدام micropipette لإضافة بضع قطرات من M9 لفصل الحيوانات. تعيين جهاز توقيت لمدة 60 ثانية للسماح للديدان للتأقلم مع السباحة. ضبط مقبض الضوء بحيث يكون العرض مشرقا قدر الإمكان دون التعرض المفرط.

اضبط تركيز الكاميرا يدويا عن طريق تحويل حلقة التركيز على جسم العدسة في الكاميرا، أثناء مشاهدة الشاشة. بعد 60 ثانية اضغط على زر التسجيل، حدد الزر الأول في قائمة سير العمل استيراد تسلسل الصورة"والعثور على وانقر نقرا مزدوجا على الفيديو. من قائمة سير العمل حدد تعيين معلومات التسلسل"في إطار القائمة الجديدة تحقق من نظام التسمية، إضافة ملاحظات، والتحقق من صحة بيانات التعريف.

حدد ضبط الصورة" وستفتح قائمة منبثقة جديدة تسمى تعديلات الصورة. ضبط إعدادات معالجة الصور عن طريق تعيين تنعيم الخلفية إلى 10، تجانس غاوسي إلى خمسة، ملء الثقوب إلى اثنين، تصفية كائن صغير إلى الصفر، وتخطي تجزئة المشتقة المتكاملة. ضبط مستوى العتبة بحيث تمتلئ الحيوانات تماما مع الأخضر، ولكن لا تزال متميزة عن الخلفية.

ثم انقر فوق تطبيق "من قائمة سير العمل، حدد الكشف عن وتتبع"حدد ثلاثة إلى سبعة الديدان وانقر فوق الكشف عن الديدان"زر في علامة التبويب الكشف. الانتقال إلى علامة التبويب تعقب. في معلمات التعقب تحقق استخدام Backtracking"و إلغاء تحديد المسار worms على حافة الصورة.

تعيين الفرضية القصوى المتعقبة إلى خمسة. تعيين وضع التتبع إلى السباحة. الانتقال إلى قسم الإعدادات المتقدمة وتعيين الإطارات worms يمكن أن تلمس الحدود إلى 50.

يمكن أن تتداخل الديدان الإطارات إلى 500. موقف التسامح إلى 0.50. وشكل التسامح إلى 0.50.

احفظ هذه الإعدادات ونشرها لجميع مقاطع الفيديو في تجربة ما عن طريق حفظها كتشكيل. انتقل إلى مدير التكوين في القائمة رمز العلوي الأيمن، وانقر فوق حفظ"أيقونة. إعطاء هذا التكوين اسم ووصف.

وانقر فوق موافق "في القائمة سير العمل، انقر فوق حفظ المشروع"تتبع أشرطة الفيديو من خلال الذهاب إلى قائمة سير العمل والنقر على دفعة"أيقونة. انقر فوق الزر إضافة "ضمن قسم تحديد الملف من هذه القائمة معالجة الدفعة. انتقل إلى وحدد كافة ملفات المشروع المراد معالجتها.

ثم انقر فوق فتح "انقر فوق الزر ابدأ" ، ولاحظ مؤشر التقدم الأخضر في الملف الأول. السماح بمعالجة كافة الملفات. عند الانتهاء من كافة الملفات المقروءة، أغلق البرنامج.

حدد تحليل البيانات"انتقل إلى ملخص المسار. واستخدم زر Export "في أسفل اليمين لتصدير البيانات بتنسيق جدول بيانات قابل للقراءة. استخدم "عدد المنعطفات" و"تعقب المدة" لحساب المنعطفات في الدقيقة لكل مسار باستخدام وظائف أغطية الانتشار.

تم قياس التشتت غير المحفز ليرقات L4 التي تم تنظيمها تنمويا من خمس سلالات مختلفة ، باستخدام اختبار الحركة الشعاعية. ورسمت على أنها متر صغير في الدقيقة الواحدة سافر. البيانات المعروضة كرسم بياني شريطي تجعل الاختلافات النسبية بين السلالات أكثر وضوحا.

في حين أن الإزاحة النهائية لكل دودة مرسومة داخل الرسم البياني ، تسمح بالتنوع داخل السكان أن يكون أفضل تصورا. تم قياس معدلات السباحة من حيث تردد الضرب أو التموج في السائل ، باستخدام تسجيل وتحليل غير متحيز بمساعدة الكمبيوتر. ورسم بياني كسحق في الدقيقة.

تجعل بيانات الرسم البياني الشريطي الاختلافات النسبية بين السلالات أسهل في الرؤية. في حين يتم رسم البيانات من كل دودة الفردية المسجلة داخل الرسم البياني، مما يسمح للتنوع داخل السكان أن يكون تصور أفضل. في المقايسة الحركية الشعاعية، لم تكن سلالة TDP-43 الخفيفة مختلفة بشكل كبير عن سلالة N2 البرية.

ومع ذلك ، في مساي السباحة ، لم تكن سلالات TDP-43 الخفيفة والقوية مختلفة بشكل كبير عن N2 البرية ، ولكن أيضا عن بعضها البعض. سلالة TDP-43 المتحولة ALS لديها ضعف الزحف الشديد من قبل حركة شعاعي، وأنها لا سحق في السائل. سلالة تاو التعبير عن ضعف شديد في الحركة الشعاعية، ولكن يمكن أن سحق في المقايسة السباحة.

الجانب الأكثر أهمية للنظر مع هذه الأساليب ، هو الحفاظ على ضوابط متسقة بين النسخ المتماثلة. وهذا يضمن أن الاختلافات في الحركة سببها الاختلافات الظاهرية وليس الظروف البيئية. وتوفر هذه الأساليب تقييما شاملا لنموذجين رئيسيين لحركية ال C.elegans.

يمكن أن تتضمن طرق المتابعة توصيفا سلوكيا إضافيا أو تحليلا كيميائيا بيولوجيا أو تحقيقا في وظيفة العضلات أو الخلايا العصبية.