تجارب NMR عالية الضغط للكشف عن حالات المطابقة منخفضة البروتين
يونيو 29, 2021
نحن نقدم وصفا مفصلا للخطوات المطلوبة لتجميع خلية الضغط العالي، وإعداد وتسجيل تجارب NMR عالية الضغط، وأخيرا تحليل كل من كثافة الذروة والتغيرات التحول الكيميائي تحت الضغط. يمكن أن توفر هذه التجارب رؤى قيمة في مسارات قابلة للطي والاستقرار الهيكلي للبروتينات.
الضغط العالي هو الطريقة المفضلة لتغيير السكان النسبية لعينة من البروتين. وهو مفيد للغاية لعزل وتميز الدول عالية الطاقة تشكيلية. بالمقارنة مع جميع طرق الاضطراب، مثل درجة الحموضة أو درجة الحرارة، من السهل تطبيق اضطراب الضغط وعكسه بالكامل.
بل هو أيضا اضطراب المحلية، التي تؤثر في المقام الأول على المناطق مع تجاويف الزجاج أو أحجام الفراغ. للبدء، أدخل عينة النيتروجين-15 المسمى في أنبوب الزركونيا باستخدام ماصة زجاجية، وضمان مقاعد العينة في الجزء السفلي من الأنبوب. لمنع العينة من الاختلاط مع السائل انتقال، تراكب العينة مع 200 ميكرولتر من النفط المعدني، ومن ثم ملء بقية الأنبوب مع السائل انتقال.
وضع O-حلقة ذات استخدام واحد على رأس أنبوب الزركونيا والانزلاق أنبوب في القاعدة. ثم قم بتوصيل الأنبوب بخط الحبل عالي الضغط وشد القاعدة بالخلية باليد. ثم تطبيق 14.7 نيوتن متر عزم الدوران لمنع تسرب في الضغط المنخفض.
للتحقق من سلامة تجميع خلايا الضغط، قم بالضغط على الأنبوب حتى 300 شريط خارج المطياف باستخدام دعم الخلية ووعاء الاحتواء. بعد 15 دقيقة، قم بإعادة ضبط الضغط على شريط واحد وتحقق من وجود تسربات بمسح نظيف خال من الوبر. أدخل الأنبوب غير المضغوط في المطياف بتوجيه خط الحبل بعناية.
قم بتمرير الأنبوب إلى مطياف حتى يصل الأنبوب إلى موضع الجلوس بالعينة. قفل، شيم، المباراة وضبط البروتيوم والنيتروجين قنوات وحفظ الشيم الأمثل للمستقبل. إعداد الاسترخاء العرضي الأمثل التحليل الطيفي مع مطياف متماسك واحد الكم غير المغايرة والمضي قدما في تسجيل تجربة مرجعية في الظروف الجوية.
سجل سلسلة من التجارب 2D من شريط واحد إلى 2.5 كيلوبار لكل 500 أشرطة. إذا كانت معدلات الطي الدقيقة أو التي تتكشف معروفة، بعد كل زيادة 500 شريط، دع العينة متساوية لمدة 15 إلى 20 دقيقة. عندما تصل نقطة انقلاب الانتقال القابل للطي أو التي تتكشف، سجل تجارب إضافية لتحسين دقة الملاءمة.
تم استخدام هذا البروتوكول للتحقيق في الاعتماد على الضغط من RRM2، والثانية الحمض النووي الريبي الاعتراف عزر غير متجانسة النووية ribonucleoprotein A1. تم جمع التحليل الطيفي الأمثل للاسترخاء العرضي باستخدام أطياف التحليل الطيفي للتماسك أحادي الكم غير المتجانس في شريط واحد و1.5 كيلوبار واثنين من الكيلوبار و2.5 كيلوبار. وRRM2 تتكشف تماما تقريبا ضمن نطاق 2.5 كيلوبار. تم تركيب ملامح كثافة الضغط الفردي وفقا للمعادلة الموضحة هنا ، للحصول على التغييرات المقابلة في الطاقة الحرة القياسية جيبس وحجم المرتبطة رد الفعل تتكشف.
عند تعيينها على هيكل المجال ، تم العثور على المخلفات ذات أكبر حجم من تغيير الحجم داخل النواة الهيكلية للمجال ، في حين أن تلك التي لها أصغر حجم من تغيير الحجم كانت موجودة بشكل رئيسي في حلقات الربط بين خيوط بيتا وخيط بيتا إلى الحلزون الطرفي C. للتحقيق في درجة الضغوط والتغايرية التركيبية لفرقة الدولة المطوية ، تم تحليل التحولات الكيميائية البروتيوم. تم تركيب ملامح فردية للتحولات الكيميائية البروتيوم كدالة للضغط باستخدام المعادلة المعروضة، لاستخراج المعاملات الخطية وغير الخطية الخاصة بالموقع.
تم العثور على المخلفات ذات أكبر المعاملات غير الخطية في الغالب في النواة الهيكلية للمجال ، في حين كانت المخلفات ذات أصغر المعاملات غير الخطية موجودة في الغالب داخل حلقات تربط بين الزخارف الهيكلية المختلفة. من المهم إعداد الأنبوب كضغط تم ضبطه بشكل صحيح ، لمنع التسرب. إذا حدث تسرب، فإن التحقيق ربما يجب إزالتها لتنظيف أي أثر للنفط المعدني.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تفصل هذه المقالة عملية تجميع خلية الضغط العالي وإعداد تجارب الرنين المغناطيسي النووي (NMR) تحت الضغط العالي. وهي تركز على تحليل شدة القمة وتغيرات الإزاحة الكيميائية تحت تأثير الضغط، مما يوفر رؤى حول مسارات طي البروتين والاستقرار البنيوي.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- الكيمياء الحيوية
- البيولوجيا التركيبية
خلفية علمية
- يؤدي الضغط العالي إلى تغيير الحالات التشكلية للبروتين.
- تعد هذه الطريقة وسيلة اضطراب عكسية.
- يؤثر الضغط بشكل أساسي على المناطق التي تحتوي على أحجام فراغية.
- مفيدة في توصيف الحالات التشكلية ذات الطاقة العالية.
الغرض من الدراسة
- لوصف خطوات تجميع خلية الضغط العالي.
- لإعداد وتسجيل تجارب NMR تحت الضغط العالي.
- لتحليل تأثيرات الضغط على بنى البروتين.
الطرق المستخدمة
- إدخال العينات الموسومة بالنيتروجين-15 في أنبوب من الزركونيا.
- تغطية العينات بالزيت المعدني لمنع الاختلاط.
- ملء الأنبوب بسائل النقل.
- تسجيل تجارب الرنين المغناطيسي النووي (NMR) تحت ضغط عالٍ.
النتائج الرئيسية
- منهجية مفصلة لإعداد الرنين المغناطيسي النووي (NMR) عالي الضغط.
- رؤى حول مسارات طي البروتين.
- تحليل التغيرات في شدة القمة والإزاحة الكيميائية.
- توصيف الاستقرار الهيكلي تحت تأثير الضغط.
الاستنتاجات
- يعد الرنين المغناطيسي النووي (NMR) تحت الضغط العالي فعالاً لدراسة ديناميكيات البروتين.
- يوفر رؤى قيمة حول الحالات التشكلية للبروتين.
- يمكن تطبيق هذه المنهجية في دراسات متنوعة على البروتينات.
الأسئلة الأكثر شيوعاً
الأهمية التنفيذية للصناعة
يتيح الرنين المغناطيسي النووي (NMR) تحت الضغط العالي لفرق الأدوية البيولوجية استقصاء الحالات التشكلية ذات الطاقة العالية والمجتمعات السكانية المنخفضة، والتي تعد حاسمة لفهم طي البروتين واستقراره وتعدده. وتعزز هذه القدرة من الثقة التنبؤية في التحقق من الأهداف وتقلل من مخاطر مراحل الاكتشاف المبكرة من خلال الكشف عن تفاصيل ميكانيكية لا يمكن الوصول إليها عبر طرق الاضطراب القياسية. كما أن دمج الرنين المغناطيسي النووي المعتمد على الضغط في سير عمل الاكتشاف يدعم فرز المحافظ الدوائية بشكل أكثر استنارة واتخاذ قرارات تطوير معدلة وفقاً للمخاطر.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الصيدلة الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- يتيح الملاحظة المباشرة للحالات التشكلية النادرة ذات الصلة بالتحقق الوظيفي من الهدف.
- يدعم تقليل المخاطر الميكانيكية من خلال رسم خرائط الاستقرار الموضعي وتحولات الطي.
- يعزز الثقة التنبؤية في اختيار الهدف عن طريق قياس الاستقرار الموضعي والشامل للبروتين.
الفحص وتطوير المقايسة
- يسهل تحضير أنظمة بروتينية موثقة لعمليات الفرز اللاحقة من خلال توصيف توازنات الطي وتكوين القليل ميرات (oligomerization).
- يوفر قراءات كمية محددة الموقع لضمان توحيد المقايسات وقابلية تكرارها.
- يتيح إجراء مقارنة قوية بين متغيرات البروتين أو تأثيرات الربيطة (ligand) تحت ظروف اضطراب خاضعة للسيطرة.
الأبحاث الترجمية وما قبل السريرية
- يربط بيانات الاستقرار البنيوي بآليات سوء طي البروتين أو تجمعه ذات الصلة بالمرض عند الاقتضاء.
- يدعم الاستمرارية من مرحلة الاكتشاف إلى التحقق قبل السريري من خلال تقديم معلومات حول التباين التشكيلي والقابلية للانضغاط.
- يقلل من مخاطر التقدم الانتقالي عبر توضيح نقاط الضعف الفيزيائية الحيوية في مرحلة مبكرة من مسار التطوير.
تكامل مسارات العمل والتدفقات التشغيلية
يندرج الرنين المغناطيسي النووي (NMR) عالي الضغط ضمن التسلسل الممتد من مرحلة الاكتشاف إلى المرحلة قبل السريرية، وذلك من خلال توفير منصة اضطراب كمية وقابلة للعكس لتوصيف البروتينات.
- بيولوجيا الاكتشاف: تدعم اختبار الفرضيات المتعلقة بآليات الطي وتوازنات التعددية (oligomerization equilibria).
- الفحص: توفر قياسات كمية وقابلة للتكرار للانتقالات التشكلية من أجل تطوير المقايسات.
- التحليلات: تولد ملفات شدة وإزاحة كيميائية محددة الموقع لمقارنة الحالات التركيبية.
- الأبحاث الترجمية: تقدم معلومات حول التغاير التشكلي ذي الصلة بنماذج الأمراض عندما يدعم نظام البروتين ذلك.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: توفر قدرة تحليلية قابلة لإعادة الاستخدام لمختلف أهداف البروتين والأسئلة الميكانيكية.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تزيد من الثقة التنبؤية وتقلل من الغموض الميكانيكي في عملية التحقق من صحة البروتينات المستهدفة.
- القيمة التشغيلية: توفر اضطراباً معيارياً وعكوساً وقابلاً للتوسع من أجل توليد بيانات قابلة للتكرار.
- القيمة الاستراتيجية: تتيح اتخاذ قرارات أفضل بشأن المتابعة أو التوقف (go/no-go) وكفاءة رأس المال من خلال توضيح العيوب الهيكلية في وقت مبكر.
- التأثير على المحفظة: تدعم تحديد الأولويات المعدلة حسب المخاطر والنهوض بالبروتينات المستهدفة بناءً على بيانات فيزيائية حيوية قوية.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في مطيافية الرنين المغناطيسي النووي (NMR) وأجهزة الضغط العالي.
- يستلزم أجهزة متخصصة، بما في ذلك خلايا الضغط العالي وأنظمة الاحتواء.
- يتطلب بروتوكولات صارمة لتحضير العينات ومنع التسرب.
- قد يتطلب ملاءمة لأنظمة بروتينية مختلفة أو استراتيجيات وسم متنوعة.
- تشمل القيود التشغيلية نطاق الضغط ووقت التوازن اللازمين لإجراء قياسات دقيقة.
