دراسة تطور الخلايا التغصنية بواسطة ضربة قاضية للجين القصير بوساطة الحمض النووي الريبي في جذع مكون للدم وخط خلية سلف في المختبر
مارس 7, 2022
نقدم هنا بروتوكولا لفحص عوامل النسخ المحتملة المشاركة في تطوير الخلايا التغصنية (DC) باستخدام نقل الفيروس اللاصق ل shRNA للحصول على خطوط خلايا ضربة قاضية مستقرة لتمايز DC في المختبر .
الخلايا التغصنية ، أو DCs ، هي خلايا مناعية رئيسية تربط بين الجهاز المناعي الفطري والتكيفي. في حين أن DCs غير متجانسة ، فإن هذه الطريقة تساعدنا على فهم الجينات ، بما في ذلك عوامل النسخ ، التي قد تنظم تطور DC. توفر هذه التقنية طريقة بسيطة وسريعة لتحديد الجين الذي يتحكم في تطور التيار المستمر من سلفه في المختبر.
للبدء ، حافظ على الخلايا الجذعية والسلفية المكونة للدم الخالدة أو iHSPCs في وسط RPMI 1640 الكامل ، مع استكمال 100 نانوغرام لكل ملليلتر من رباط FLT3 واستراديول بيتا ميكرومولار واحد. بالنسبة لنقل الفيروس ، قم بلوحة iHSPCs في 12 لوحة بئر بكثافة واحدة من 10 إلى الخلايا الخامسة لكل بئر وملليلتر واحد من الوسط الكامل الذي يحتوي على رابط FLT3 وبيتا استراديول والبوليبرين. ثم أضف فيروس lentivirus الذي يحمل الحمض النووي الريبي القصير في كل بئر في عدد كبير من العدوى يبلغ 100.
بعد ذلك ، قم بتدوير اللوحة عند 1100 مرة g و 37 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة ، ثم احتضن الخلايا المصابة بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية. في اليوم التالي ، قم بإزالة البوليبرين عن طريق جمع الخلايا في أنابيب 15 ملليلتر في الطرد المركزي ، بعد استبدال الوسائط بوسط كامل جديد يحتوي على FLT3 ligand و beta estradiol. بعد 24 ساعة إضافية ، أضف ستة ميكروغرام لكل ملليلتر من البوروميسين إلى الوسط لتحديد الخلايا المصابة.
استبدل وسيط التحديد كل ثلاثة أيام وحافظ على الخلايا لمدة أسبوع واحد على الأقل لتوسيع iHSPCs المحولة بثبات. قم بإنشاء والحفاظ على iHSPCs ضربة قاضية مستقرة ل LacZ و Tcf4 و Id2 في وسط كامل مكمل ب FLT3 ligand و beta estradiol. لبدء التمايز في المختبر ، قم بجمع iHSPCs غير المتمايزة في أنابيب 15 ملليلتر وتكوير الخلايا عن طريق الطرد المركزي.
بعد الطرد المركزي ، تخلص من المادة الفائقة واغسل الخلايا مرتين ب 10 ملليلتر من PBS. بعد الغسيل الثاني ، أعد تعليق الخلايا في وسط كامل يحتوي فقط على رابط FLT3 ثم زرعها بكثافة مرتين 10 إلى الخامسة التي تباع لكل ملليلتر في صفيحة بئر 12. بعد ثلاثة أيام ، أضف ملليلتر واحد من الوسط الكامل الطازج الذي يحتوي على رابط FLT3.
بعد يومين إضافيين ، انتقل إلى تحليل الخلايا المتمايزة عن طريق قياس التدفق الخلوي. لتحليل التدفق الخلوي ، قم بماصة الخلايا لأعلى ولأسفل مرتين إلى ثلاث مرات في اللوحة ثم قم بجمع الخلايا في أنابيب 1.5 ملليلتر. قم بطرد الأنابيب وتخلص من المادة الفائقة قبل إعادة تعليق الخلايا في 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت للفاكس.
بعد ذلك ، أضف 50 ميكرولتر من مضاد CD16 بواسطة 32 hybridoma supernatant واحتضن لمدة خمس إلى 10 دقائق على الجليد. ثم ، أضف الأجسام المضادة المترافقة بصبغة الفلورسنت مباشرة إلى الخلايا واحتضنها لمدة 15 دقيقة على الجليد في الظلام. بعد الحضانة ، اغسل الخلايا بمليلتر واحد من المخزن المؤقت للفاكس وقم بطرد العينة.
بعد الطرد المركزي ، أعد تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للفاكس وقم بتحليل العينات عن طريق قياس التدفق الخلوي. بعد الضربة القاضية القصيرة بوساطة الحمض النووي الريبي ل LacZ و Tcf4 و Id2 في iHSPCS ، أظهر تأكيد كفاءة الضربة القاضية بواسطة RTQ-PCR أن التعبير عن الضربة القاضية Tcf4 و Tcf4 تم تقليله مقارنة بالضربة القاضية iHSPCs في LacZ. وقد لوحظت نتائج مماثلة للتعبير عن Id2 في الضربة القاضية Id2 iHSPCs.
بعد زراعة LacZ ضربة قاضية iHSPCs لمدة خمسة أيام ، كان تواتر الخلايا الإيجابية CD11c ، التي تمثل مجموعة الخلايا التغصنية ، حوالي 95 ٪ ومع ذلك ، فإن هدم Tcf4 أو Id2 قلل قليلا من توليد الخلايا التغصنية الإيجابية CD11c. كشف مزيد من التحليل للخلايا التغصنية الإيجابية CD11c المشتقة من ضربة قاضية LacZ iHSPCs أن 70٪ كانت خلايا تغصنية تقليدية بينما كانت 22٪ خلايا تغصنية بلازماسيتويد. ولدت الضربة القاضية Tcf4 iHSPCs نسبة أقل بكثير من الخلايا التغصنية البلازمية التي تتحكم فيها ضربة LacZ.
في المقابل ، ولدت iHSPCs الضربة القاضية Id2 نسبة أقل بكثير من الخلايا المتغصنة التقليدية من عناصر التحكم في ضربة قاضية LacZ ولكن نسبة أعلى من الخلايا التغصنية البلازميتويدية. تزيد عدوى الدوران من كفاءة نقل الحمض النووي الريبوزي المرسال الحامل للفيروس إلى iHSPCs. تتناول هذه التقنية دور عوامل النسخ وتسهل دراسة الجينات الأخرى في نقل إشارات السيتوكين أو التمثيل الغذائي ، والتي من المحتمل أن تشارك في تطوير DC.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تعرض هذه المقالة بروتوكولاً لفحص عوامل النسخ التي تؤثر على تطور الخلايا الغصنية (DC) من خلال نقل shRNA بواسطة الفيروسات البطيئة. وتتيح هذه الطريقة إنشاء خطوط خلوية مستقرة ذات تعطيل جيني (knockdown) لتمايز الخلايا الغصنية في المختبر.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- علم المناعة
- بيولوجيا الخلية
- التنظيم النسخي
خلفية علمية
- تعد الخلايا الغصنية ضرورية للربط بين المناعة الفطرية والتكيفية.
- يمكن أن يكشف فهم تطور الخلايا الغصنية عن رؤى حول الاستجابات المناعية.
- تركز هذه الدراسة على تحديد الجينات التي تنظم تمايز الخلايا الغصنية.
- تستخدم هذه الطريقة خلايا جذعية وسلفية مكونة للدم مخلدة.
الغرض من الدراسة
- تطوير بروتوكول لفحص عوامل النسخ في تطور الخلايا dendrtic cells.
- إنشاء خطوط خلوية ذات تثبيط مستقر (knockdown) للدراسات الوظيفية.
- تسهيل تمايز الخلايا dendrtic cells مخبرياً من الخلايا السلفية.
الطرق المستخدمة
- الحفاظ على الخلايا الجذعية والطلائعية المكونة للدم المستحثة (iHSPCs) في وسط RPMI 1640 كامل.
- التدعيم بربيطة FLT3 وبيتا استراديول.
- النقل الجيني للفيروسات البطيئة (Lentiviral transduction) للخلايا iHSPCs باستخدام shRNA.
- استخدام polybrene لتعزيز كفاءة النقل الجيني.
النتائج الرئيسية
- توليد ناجح لخطوط خلوية مستقرة ذات تثبيط جيني (knockdown).
- تحديد عوامل النسخ المشاركة في تطور الخلايا الشجرية (DC).
- إثبات قدرات التمايز في المختبر (in vitro).
- رؤى حول التنظيم الجيني لتطور الخلايا المناعية.
الاستنتاجات
- يوفر هذا البروتوكول طريقة موثوقة لدراسة تطور الخلايا الغصنية (DC).
- يمكن استخدامه لتحديد الجينات التنظيمية الرئيسية في علم المناعة.
- قد يعزز هذا النهج من فهم الاستجابات المناعية.
الأسئلة الشائعة
الأهمية التنفيذية للصناعة
تتيح هذه الطريقة الاستقصاء المنهجي لوظيفة عوامل النسخ في تحديد سلالة الخلايا التغصنية، مما يدعم التحقق من الأهداف في برامج الاكتشاف التي تركز على علم المناعة. ومن خلال ربط الاضطراب الجيني بالناتج الظاهري في نظام مخبري قابل للتكرار، فإنها توفر تقليلاً للمخاطر الميكانيكية للفرضيات المتعلقة بالأهداف في مراحلها المبكرة. ويعزز هذا النهج الثقة التنبؤية في تحديد أولويات الأهداف المعدلة للمناعة قبل البدء في جهود تحديد المركبات الرائدة التي تتطلب موارد مكثفة.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية البيولوجية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: تتيح الاستقصاء الوظيفي لعوامل النسخ كأهداف علاجية محتملة في تطور الخلايا التغصنية.
- القيمة التشغيلية: توفر منصة قابلة للتوسع لفحص الإسكات الجيني باستخدام توصيل shRNA عبر الفيروسات البطيئة في السلفات المكونة للدم الخالدة.
- القيمة التنبؤية: تربط بين تعديل الهدف ومخرجات المجموعات الفرعية للخلايا التغصنية، مما يدعم قرارات المضي قدماً أو التوقف بناءً على بيانات انحراف السلالة.
الفحص وتطوير المقايسة
- القيمة العلمية: يُنتج قراءات كمية لتقنية قياس التدفق الخلوي للخلايا الموجبة لـ CD11c وتوزيع المجموعات الفرعية (cDC مقابل pDC) بعد تثبيط عامل النسخ.
- القيمة التشغيلية: يؤسس مقايسة تمايز معيارية بظروف محددة من السيتوكينات (رابط FLT3، وبيتا استراديول) والاصطفاء بواسطة puromycin.
- جاهزية المقايسة: يُنتج خطوط خلوية مستقرة ذات تثبيط جيني مناسبة للاستخدام المتكرر في فحص المركبات أو دراسات تعديل المسارات.
الأبحاث الترجمية والقبل سريرية
- القيمة الترجمية: ينمذج هذا العمل التحديد المبكر للخلايا الشجرية من الخلايا السلفية، مما يوجه استراتيجيات المؤشرات الحيوية المرتبطة بشبكات عوامل النسخ.
- تقليل المخاطر الآلية: يوضح دور Id2 في تعزيز مصير الخلايا الشجرية التقليدية، ودور Tcf4 في دعم تطور الخلايا الشجرية البلازمية.
- المواءمة قبل السريرية: يدعم تقييم الأهداف التي تؤثر على تمايز الخلايا المناعية ذات الصلة ببرامج المساعدات اللقاحية أو أمراض المناعة الذاتية.
تكامل مسار العمل والتدفق
تندرج هذه الطريقة ضمن مرحلة بيولوجيا الاكتشاف، مما يتيح اختبار فرضيات الأهداف قبل تطوير المقايسة الخاصة بتحديد المركبات الرائدة، مع توفير بيانات تدعم اختيار المرشحات قبل السريرية في مجال التعديل المناعي.
- بيولوجيا الاكتشاف: تدعم التشريح الميكانيكي للمنظمات النسخية التي تحكم التزام سلالة الخلايا التغصنية من السلائف المكونة للدم.
- تطوير المقايسات: تنتج نقاط نهاية كمية وقابلة للتكرار باستخدام التألق المناعي وقياس التدفق الخلوي لمراقبة كفاءة التمايز وتوزيع المجموعات الفرعية.
- التحليلات: تقدم قراءات قابلة للقياس (نسبة CD11c+، وcDC، وpDC) تسمح بالمقارنة عبر ظروف تثبيط الجينات وتدعم التقييم الإحصائي لتأثير الهدف.
- الأبحاث الانتقالية: تربط تمايز السلائف المبكرة بالوظيفة المناعية اللاحقة، وهو أمر ذو صلة بنمذجة الاستجابات في حالات العدوى أو تحمل المناعة.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: تؤسس منصة قابلة لإعادة الاستخدام لفحص جينات إضافية في إشارات السيتوكينات، أو التمثيل الغذائي، أو الشبكات النسخية التي تؤثر على تطور الخلايا التغصنية.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تزيد من الثقة في التحقق من صحة الأهداف من خلال ربط تثبيط عامل النسخ بتغيرات قابلة للقياس في توليد مجموعات فرعية من الخلايا التغصنية.
- القيمة التشغيلية: تتيح توحيد بروتوكولات التمايز والقراءة عبر المختبرات من خلال تحديد ظروف الوسط وعلامات الاختيار.
- القيمة الاستراتيجية: تقلل من المخاطر البيولوجية في اختيار الأهداف المعدلة للمناعة من خلال توفير أدلة وظيفية مبكرة على التأثيرات الخاصة بالسلالة.
- التأثير على المحفظة: توجه تحديد أولويات الأهداف المعدلة وفقاً للمخاطر بناءً على تأثيرها على قرارات مصير الخلايا التغصنية، مما يدعم التخصيص الفعال للموارد.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في ترنسدكشن الفيروسات البطيئة، وزراعة الخلايا المكونة للدم، وتدفق السيتومتري.
- يعتمد على توفر مكتبات shRNA الفيروسية البطيئة، والانتخاب باستخدام puromycin، والأوساط المكملة بالسيتوكينات (FLT3 ligand و beta estradiol).
- يستلزم توحيد كفاءة الترنسدكشن (على سبيل المثال، عبر العدوى بالدوران) ومدة الانتخاب لتوليد تثبيط جيني مستقر.
- يتضمن تحسين توقيت التمايز ولوحات الأجسام المضادة لتحديد دقيق للمجموعات الفرعية للخلايا الشجرية بواسطة تدفق السيتومتري.
- يقتصر على النمذجة في المختبر؛ وتتطلب النتائج التحقق منها في أنظمة بشرية أولية أو أنظمة فئران لضمان الصلة الانتقالية.
الأسئلة الشائعة حول الصناعات الدوائية الحيوية
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:43
Preparation of Immortalized HematopoieticStem and Progenitor Cell (iHSPC) Lines and Lentiviral Transduction
2:08
In Vitro Differentiation of the Stable Knockdown iHSPC Cell Lines
3:05
Flow Cytometric Analysis of the Differentiated Dendritic Cells
4:01
Results: Dendritic Cell Differentiation Following Short Hairpin RNA-Mediated Tcf4 and Id2 Knockdown
5:33
Conclusion
