دراسات الارتباط واسعة النطاق متعددة الأوميكس على نطاق الجينوم (Mo-GWAS): مبادئ توجيهية لإعداد العينات وتطبيعها

يأتي التحقيق في عدد أكبر من السكان مع تباين مدفوع بالآلة ، والذي من خلال هذا التباين الفعلي الناشئ عن التنوع الطبيعي. نوضح هنا طريقة لتقليل التباين الفني لتحليل التكامل النهائي. تشمل مزايا هذه التقنية الاستخراج القائم على فصل الوجه ، مما يوفر تحليل المستقلبات المختلفة على المنصة التحليلية المعنية ، مع إزالة الخطأ النظامي والحفاظ على التباين البيولوجي.

بمجرد الحصول على معلومات النمط الوراثي والمظهري ، يمكن تطبيق هذه الطريقة على أي مجموعة طبيعية متنوعة في أي مملكة حياة. للبدء في أخذ أنابيب حصاد 20 ملليلتر ، أضف خرزتين معدنيتين قطرهما ثمانية ملليمترات لتجانس الأنابيب وتسميتها. ثم ، املأ ديوار بالنيتروجين السائل ، مباشرة بعد قطع عينات الأوراق والأنسجة الجذرية الطازجة في النيتروجين السائل عن طريق التجميد السريع.

تخزين العينات البيولوجية المحصودة عند 80 درجة مئوية لمزيد من المعالجة. قم بتبريد حاملات الأنابيب مسبقا في النيتروجين السائل. بعد ذلك ، قم بطحن الأنسجة عند 25 هرتز لمدة دقيقة واحدة للحصول على مسحوق متجانس.

كرر التجميد والطحن إذا لم تكن الأنسجة مطحونة بشكل متجانس. وزن 50 ملليغرام من المواد النباتية الطازجة في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة الآمنة ذات القفل المبردة مسبقا والتي تحمل علامة مليمترين لضمان بقاء المواد النباتية مجمدة أثناء عملية الوزن. أضف ملليلتر واحد من خليط الاستخراج المبرد مسبقا من 1 إلى 50 ملليغرام من العينة ، ودوامة الأنبوب لفترة وجيزة قبل الاحتفاظ به على الثلج.

احتضن العينات على شاكر مداري بسرعة 800 مرة G لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية ، تليها الصوتنة في حمام صوتنة مبرد بالجليد لمدة 10 دقائق. استخدم ماصة متعددة القنوات لإضافة 500 ميكرولتر من خليط الاستخراج أيضا إلى العينات وخلط المستخلصات عن طريق دوامة قصيرة ، ثم الطرد المركزي للخليط عند 11،200 مرة G لمدة 5 دقائق عند أربع درجات مئوية. بعد الطرد المركزي ، قم بنقل 500 ميكرولتر من المرحلة العلوية المنفصلة المحتوية على الدهون إلى أنبوب طرد مركزي آمن 1.5 ملليلتر محدد مسبقا ، وإزالة بقية المرحلة العليا.

في أنابيب منفصلة ، قفل آمن 1.5 ملليلتر ، تنقل أنابيب الطرد المركزي الدقيقة 150 ميكرولتر من المرحلة شبه القطبية السفلى أربعة GCMS و 300 ميكرولتر من المرحلة شبه القطبية الرابعة U-H-P-L-C MS تحليل. استخدم مكثف فراغ لتبخر المذيبات لتركيز جميع الكسور المستخرجة دون تسخين وتخزين الكسور المجففة عند 20 درجة مئوية. لإعداد العينة للأداء العالي للغاية ، يعيد الكروماتوغرافيا السائلة أو قياس الطيف الكتلي أو H-P-L-C MS تعليق الأجزاء شبه القطبية المجففة في 180 ميكرولتر من خليط من الميثانول والماء.

ثم سونيك المرحلة شبه القطبية لمدة دقيقتين ، تليها الطرد المركزي في 11،200 مرة G لمدة دقيقة واحدة. بعد الطرد المركزي ، انقل 90 ميكرولتر من السوبرناتانت إلى قارورة زجاجية وحقن ميكرولترين من المستخلصات في عينة LCMS المصبوبة. قم بإجراء تجزئة الأيض على عمود Phase C18 معكوس يتم الاحتفاظ به عند 40 درجة مئوية ، وتدفق 400 ميكرولتر في الدقيقة مع التغيرات التدريجية للنفايات السائلة A و B ، والحصول على أطياف الكتلة للاختبار فارغة وعينات مراقبة الجودة في وضع التأين السلبي مع نطاق كتلة 102 1500 كتلة إلى نسبة الشحن.

بالنسبة لعينات المستقلبات شبه القطبية، قم بتشغيل عينة مراقبة الجودة المجمعة في قياس الطيف الكتلي الترادف المعتمد على البيانات في أوضاع التأين السلبية والإيجابية. استخدم أطياف الكتلة التي تم الحصول عليها للتعليق التوضيحي. قم بإجراء تطبيع مجموعة البيانات عن طريق التحقق من توزيع المعيار الداخلي.

تطبيع البيانات عن طريق تصحيح إشارة معايير داخلية واحدة أو متعددة. بعد ذلك ، قم بتصحيح كثافة الذروة التي تم الحصول عليها من الكروماتوجرام على وزن العينة الدقيق. لتصحيح انحراف الشدة عبر سلسلة الدفعات المتعددة ، قم بإجراء طرق تصحيح قائمة على مراقبة الجودة مثل تجانس مخطط التشتت المقدر محليا باستخدام R.قبل إجراء دراسات الارتباط على نطاق الجينوم أو GWAS ، قم بتصفية بيانات النمط الجيني لترددات الأليل الثانوية أقل من 5٪ ومعدل مفقود يزيد عن 10٪ باستخدام شرابة.

هذا سوف يتجنب التحيز منخفض التردد. للقضاء على التحيز الناشئ عن العوامل البيئية ، استخدم حزمة R LME Four واحسب أفضل التنبؤات أو النقط الخطية وغير المتحيزة لكل ميزة طبيعية على التكرار التجريبي. استخدم نقاط من كل ميزة على حدة لأداء GWAS مع حزمة rMVP في R.يتم عرض البيانات الدهنية عبر العديد من أنواع الفاصوليا الشائعة بناء على كروماتوغرام الذروة الأساسي الخام لعينتين من مراقبة الجودة من دفعات مختلفة.

لوحظ اختلاف في كثافة الإشارة لبعض فئات الدهون. كان الخطأ المنهجي أكثر وضوحا عندما تم إجراء تحليل المكون الرئيسي على البيانات الخام. أدى إجراء التطبيع ، بما في ذلك تجانس مخطط التشتت المقدر محليا ، إلى تجميع عينات مراقبة الجودة.

عند التشريح إلى مجموعات فردية ، أصبحت الأخطاء التي تحركها الآلة في الدفعتين السابعة والثامنة واضحة قبل التطبيع ، والتي تم تصحيحها. تم استخدام مجموعات الأيض الفردية بعد التطبيع والتحويل ل GWAS، مما أدى إلى العديد من ارتباطات علامات السمات. في التحليل التمثيلي ، يتم تمييز فئات المركبات المختلفة بألوان مختلفة ، في حين تتم الإشارة إلى العلامات المرتبطة بفئات مركبة متعددة بأقرب جين لها.

يعد تطبيع البيانات وتحويلها أحد أهم الخطوات. تأكد من إجراء التصحيح المناسب لتصحيح الخطأ النظامي ، وضمان الوضع الطبيعي في التوزيع. من خلال إجراء تصحيح للتباين التحليلي ، يمكن تنفيذ العديد من نهج التكامل ، مثل تحليل الارتباط الأيضي والاندماج في البيانات الظاهرية لإلقاء الضوء على السمات المعقدة.