دراسات التفاعلات Chaperone-Cochaperone باستخدام المتجانسة حبة القائم على المقايسة
يوليو 21, 2021
يقدم هذا البروتوكول تقنية للتحقيق في التفاعلات بين البروتين والبروتين باستخدام حبات المانحين المرتبطة بالجلوتاثيون مع مرافقين مشاركين من TPR-motif من GST وخرزات مقبولة إلى جانب ببتيد مشتق من Hsp90. لقد استخدمنا هذه التقنية لفحص الجزيئات الصغيرة لتعطيل تفاعلات Hsp90-FKBP51 أو Hsp90-FKBP52 وحددنا مثبطات تفاعل Hsp90-FKBP51 القوية والانتقائية.
بنينا مقاما متجانسا قائما على الخرز لدراسة التفاعلات بين المرافقين والكوشابيرون. باستخدام هذه التقنية، نقوم بفحص الجزيئات الصغيرة التي تمنع التفاعلات بين Hsp90 و FKDP51 أو FKBP52 وتحديد مثبطات قوية وانتقائية. تقنية الفحص عالية الإنتاجية هذه قوية وموثوقة.
يمكن الحصول على النتائج في غضون ساعة واحدة، ويتطلب سوى كميات صغيرة من بروتين الخرز والمركبات. وكان التفاعل Hsp90 مع هذا cochaperones متورطة في اضطرابات بشرية، مثل مرض الزهايمر والسرطان وأمراض المناعة الذاتية. توفر هذه التقنية الفرصة لفحص مثبطات مرافق الكوشابيرون ذات الأهمية الطبية العالية.
وهنا المبدأ الأساسي لهذا المقايسة. عندما التفاعل بين Hsp90C-محطة الببتيد وتي بي آر المجال من cochaperones يجلب المانح والخرز المقبول في القرب، يتم إنشاء إشارة تضخيم للغاية. عند إضافة مثبطات التفاعل، لا يمكن للمانح والخرز المقبول الوصول إلى القرب، ولا يتم إنتاج أي إشارة يمكن اكتشافها.
تبدأ بتخفيف الببتيد Hsp90 في برنامج تلفزيوني في مليغرام واحد لكل تركيز ملليلتر. تمييع الخرز المقبول غير المترافق في PBS ، ونقل الخرز إلى أنبوب 1.5 ملليلتر. طرد مركزي الخرز المخفف لغسل، ومن ثم إزالة بعناية supernatant.
للترافق، تعيين حبات المقبول في الببتيدات بنسبة 10 إلى 1. إلى حبات paletide في برنامج تلفزيوني الببتيد المخفف، توين 20 والصوديوم cyanaboroughhydride الحل، واحتضان مع نهاية على نهاية التحريض على شاكر دوارة. لمنع المواقع غير المنقحة، إضافة 20 ميكرولتر من محلول واحد الأضراس تريس هيدروكلوريد من درجة الحموضة 8.0 إلى الخرز، وإرواء رد الفعل عن طريق احتضان لمدة ساعة واحدة في 37 درجة مئوية.
في نهاية الحضانة، اغسل الخرز عن طريق الطرد المركزي وإعادة تعليق بيليه الخرز في ملليلتر واحد من محلول ثلاثي هيدروكلوريد. كرر الغسيل مرتين أخريين. بعد الغسيل الأخير، إعادة تعليق الخرز في مليغرام واحد لكل تركيز ملليلتر في المخزن المؤقت وتخزين حل حبة المقبول المترافق في 4 درجات مئوية محمية من الضوء.
إضافة حبات المانحة الجلوتاثيون في 10 ميكروغرام لكل تركيز ملليلتر في برنامج تلفزيوني. أضف GSTFKBP51 إلى تركيز نهائي قدره 10 ميكروغرام لكل ملليلتر واحتضان التفاعل لمدة 10 دقائق عند 25 درجة مئوية في الظلام. جعل التخفيفات التسلسلية من مركب الاختبار في DMSO.
إضافة 0.25 ميكرولتر من تخفيف مركب الاختبار وثلاثة أمثال في زاوية كل بئر من لوحة بئر 384. للتحكم السلبي، أضف 0.25 ميكرولتر من DMSO وللتحكم الإيجابي، أضف 0.25 ميكرولتر من الببتيد Hsp90 C-Terminal في الآبار. إضافة 22.5 ميكرولتر من الحل الذي يحتوي على حبات المانحة الجلوتاثيون مع البروتينات الموسومة GST إلى كل بئر.
يهز لوحة جيدا مع اليدين واحتضان في الظلام في 25 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. تمييع حبات المقبول مع الببتيد Hsp90C-Terminal المرفق إلى 100 ميكروغرام لكل تركيز ملليلتر في 0.5 مرة PBS. إضافة 2.25 ميكرولتر من حبات المقبول المخفف إلى كل بئر.
يهز واحتضان لوحة في الظلام لمدة 15 دقيقة كما هو موضح. قم بتشغيل أداة قارئ اللوحة، و قم بقياس إشارة اللوحة و قم بتحليل البيانات كما هو موضح في مخطوطة النص. إنشاء جدول بيانات س ص في الحوار الترحيب، حدد أرقام س، ص وأدخل ثلاث قيم النسخ المتماثل في الأعمدة جنبا إلى جنب.
استيراد قيم التركيز إلى العمود X وقيم الإشارة إلى العمود ص. انقر فوق تحليل، وحدد تحويل التركيز X، ثم حدد تحويل إلى لوغاريتمات. انقر فوق تحليل واختيار الانحدار غير الخطي ضمن تحليل س ص.
فتح خيار تثبيط استجابة الجرعة واختيار سجل مقابل استجابة متغير المنحدر المعادلة. انقر فوق موافق لعرض النتائج التي تحتوي على قيمة IC50 والرسوم البيانية. تم استخدام هذا المقايسة لفحص الجزيئات الصغيرة ، مما يمنع التفاعلات بين Hsp90 و FKBP51 أو FKBP52.
درجة Z من أكثر من 0.8 ونسبة الإشارة إلى الخلفية من 13.35، تثبت قوة وموثوقية لفحص الإنتاجية العالية. تم تقييم تأثير مركب اختبار الوزن الجزيئي الصغير D10 على تثبيط التفاعلات بين المرافقين والكوشابيرون وتم حساب قيم IC50 ، حيث أظهرت D10 تثبيطا يعتمد على الجرعة. كانت قيمة IC50 لتفاعلات Hsp90 GSTFKBP51 65 نانومولار.
في حين أن لHsp90، GSTFKBP52 التفاعلات، لم يتحقق تثبيط كامل مع تركيز أعلى مركب يشير إلى أنه يمكن تحقيق تثبيط انتقائي للتفاعل البروتين البروتين مع جزيئات صغيرة. والخطوة الحاسمة هي ترتيب الإضافة. نحن أول تشكيل مجمع بين جزيء صغير وهدفه TPR.
وإلا فإن الحضانة الأطول وتركيزات المركب الأعلى مطلوبة. يمكننا استخدام هذه التقنية لفحص الجزيئات الصغيرة التي تعطل التفاعل بين Hsp90 و FKB51 أو Hsp90 و FKB52. ويمكن أيضا أن تمتد إلى أي تفاعل بين Hsp90, Hsp70 و عزر TPR التي تحتوي على مثبطات فحص الكوشابيروني الانتقائية.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
يصف هذا البروتوكول مقايسة متجانسة تعتمد على الخرزات لدراسة التفاعلات بين المرافقات البروتينية والمرافقات المساعدة، وتحديداً بين Hsp90 وFKBP51 أو FKBP52. وتسمح هذه التقنية بإجراء مسح عالي الإنتاجية للجزيئات الصغيرة لتحديد المثبطات القوية لهذه التفاعلات، والتي ترتبط باضطرابات بشرية متنوعة.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- علم الأعصاب
- الكيمياء الحيوية
- علم الأدوية
خلفية علمية
- بروتين Hsp90 هو بروتين مرافق يشارك في طي البروتينات الأخرى.
- يعد FKBP51 وFKBP52 مرافقات مشتركة تتفاعل مع Hsp90.
- قد يكون لتعطيل هذه التفاعلات تداعيات علاجية.
- ترتبط هذه التفاعلات بأمراض مثل الزهايمر، والسرطان، واضطرابات المناعة الذاتية.
الغرض من الدراسة
- تطوير مقايسة موثوقة لفحص مثبطات التفاعلات بين Hsp90 والمرافقات البروتينية (cochaperones).
- تحديد الجزيئات الصغيرة التي تعطل بشكل انتقائي تفاعلات Hsp90-FKBP51 أو Hsp90-FKBP52.
- توفير طريقة للفحص عالي الإنتاجية بمتطلبات عينات دنيا.
الطرق المستخدمة
- مقايسة متجانسة تعتمد على الخرز باستخدام خرز مانح مرتبط بالجلوتاثيون.
- مرافقات شابيرونية (co-chaperones) ذات نمط TPR مدمجة مع GST، وخرز مستقبل يحتوي على ببتيدات مشتقة من Hsp90.
- فحص عالي الإنتاجية للجزيئات الصغيرة.
- إمكانية الحصول على نتائج سريعة في غضون ساعة واحدة.
النتائج الرئيسية
- تحديد المثبطات القوية والانتقائية لتفاعلات Hsp90-FKBP51.
- إثبات متانة وموثوقية المقايسة.
- إمكانية فحص المركبات ذات الصلة الطبية العالية.
- تدعم النتائج إجراء المزيد من الاستقصاءات حول التطبيقات العلاجية.
الاستنتاجات
- تعد المقايسة المطورة فعالة لدراسة التفاعلات بين البروتينات المرافقة والبروتينات المرافقة المساعدة.
- تتيح هذه المقايسة تحديد مثبطات الجزيئات الصغيرة ذات الأهمية السريرية المحتملة.
- يمكن لهذه التقنية أن تدفع عجلة الأبحاث في علاجات الأمراض المرتبطة بتفاعلات Hsp90.
الأسئلة الشائعة
الأهمية التنفيذية للصناعة
يتيح استهداف التفاعلات بين Hsp90 والمرافقات البروتينية (cochaperones) تعديلاً انتقائياً لمسارات التأشير ذات الصلة بالأمراض، مما يوفر استراتيجية دقيقة للتدخل العلاجي في أمراض الأورام، والتنكس العصبي، والاضطرابات المناعية الذاتية. ويوفر المقايس القائم على الخرزات المتجانسة منصة قوية وقابلة للتوسع للتحقق من الأهداف في المراحل المبكرة وتحديد المركبات الرائدة من خلال قياس كمية تعطيل التفاعل بين البروتينات في بيئة متجانسة. ويدعم ذلك تقليل المخاطر الميكانيكية وتعزيز الثقة التنبؤية في تحديد أولويات السلاسل الكيميائية ذات الملفات التثبيطية الانتقائية لـ Hsp90-FKBP51 أو Hsp90-FKBP52.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير الصيدلاني الحيوي
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: تتيح استقصاء التفاعلات الثنائية بين Hsp90-FKBP51 وHsp90-FKBP52 للتحقق من ارتباط الهدف وخصوصية المسار.
- القيمة التشغيلية: تتطلب الحد الأدنى من البروتين والمركب، مما يدعم عمليات الفحص في المراحل المبكرة مع محدودية توافر المواد.
- القيمة التنبؤية: تحدد المثبطات الانتقائية (على سبيل المثال، D10 بتركيز IC50 قدره 65 nM لـ FKBP51) لتقليل مخاطر التأثيرات خارج الهدف وتعزيز الثقة في فرضية الهدف.
الفحص وتطوير المقايسة
- القيمة العلمية: يوفر قراءات كمية ومتجانسة (Z’ > 0.8, S/B = 13.35) مناسبة لحملات الفحص عالية الإنتاجية.
- القيمة التشغيلية: يتم الحصول على النتائج في غضون ساعة واحدة، مما يتيح التكرار السريع واتخاذ قرارات مناسبة في الوقت المحدد بشأن المتابعة أو الإيقاف في مرحلة تطوير المركبات الواعدة إلى مركبات رائدة (hit-to-lead progression).
- قيمة التكرارية: تضمن خطوات ربط الخرزات والمنع المعيارية اتساق المقايسة عبر مرات التشغيل والمختبرات المختلفة.
الأبحاث الترجمية وما قبل السريرية
- القيمة العلمية: يدعم فحص المركبات التي تعطل تفاعلات Hsp90-cochaperone المرتبطة بمرض الزهايمر، والسرطان، واضطرابات المناعة الذاتية.
- القيمة التنبؤية: يتيح التقييم المبكر لانتقائية الهدف، مما يساعد في اختيار المرشحين ذوي الملامح الميكانيكية المواتية للتطوير في المرحلة ما قبل السريرية.
- قيمة الاستمرارية: تترجم مخرجات المقايسة (IC50، والاستجابة للجرعة) مباشرة إلى سير عمل تقييم الفعالية والسلامة في المراحل اللاحقة.
تكامل مسار العمل وسير العمل
يندرج هذا المقايسة ضمن سلسلة مراحل الاكتشاف المبكرة، حيث تدعم التحقق من الهدف من خلال التأكيد الكيميائي الحيوي لتعطيل التآزر بين Hsp90 والبروتينات المرافقة (cochaperones)، وتتيح تحديد المركبات الرائدة عبر الفرز عالي الإنتاجية لمكتبات الجزيئات الصغيرة.
- بيولوجيا الاكتشاف: تتحقق من ارتباط الهدف عن طريق قياس تعطيل تفاعلات Hsp90-FKBP51 أو Hsp90-FKBP52، مما يوضح آلية العمل.
- الفحص المسحي: توفر جاهزية المقايسة من خلال قيمة Z’ قوية ونسبة إشارة إلى الخلفية، مما يضمن تقييماً موثوقاً للمركبات في تنسيق 384-well.
- التحليلات: تُنتج بيانات الاستجابة للجرعة وقيم IC50 عبر الانحدار غير الخطي، مما يتيح مقارنة كمية لقوة المثبط وانتقائيته.
- الأبحاث الانتقالية: تربط الأنظمة ذات الصلة بالأمراض من خلال فحص مثبطات التفاعلات المرتبطة بالاضطرابات البشرية، مما يدعم التحقق من الهدف المتوافق مع المؤشرات الحيوية.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: يمكن توسيع المنصة لتشمل تفاعلات Hsp70/Hsp90-TPR cochaperone الأخرى، مما يزيد من العائد على الاستثمار عبر عائلات متعددة من الأهداف.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تقليل المخاطر الميكانيكية من خلال التثبيط الانتقائي لـ Hsp90-FKBP51 مقارنة بـ Hsp90-FKBP52، مما يقلل من الغموض في تعديل الهدف.
- القيمة التشغيلية: الاستهلاك المنخفض للعينات (الخرز، البروتين، المركبات) والسرعة في الحصول على النتائج (أقل من 1 hour) يزيدان من كفاءة الفحص.
- القيمة الاستراتيجية: تتيح اتخاذ قرارات مبكرة بالاستمرار أو التوقف بناءً على انتقائية الهدف، مما يحسن كفاءة رأس المال ويقلل من مخاطر الفشل في المراحل المتأخرة.
- التأثير على المحفظة: تدعم ترتيب الأولويات المعدلة حسب المخاطر للسلاسل الكيميائية ذات الارتباط المستهدف الموثق وملفات الانتقائية المعتمدة.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في تنقية البروتينات (نطاقات TPR الموسومة بـ GST) وكيمياء اقتران المقايسات القائمة على الخرزات.
- يعتمد على توفر قارئ لوحات قادر على اكتشاف التألق الحيوي ومتوافق مع تنسيقات 384 بئراً.
- يستلزم توحيد نسب اقتران الببتيد بالخرزات (10:1) وظروف الحجب (1 M Tris، pH 8.0) لضمان الاتساق بين الدفعات.
- يتطلب التكيف مع مرافقات بديلة إعادة التحقق من اقتران الخرزات وحركية التفاعل.
- قيد عملي: قد تتأثر حساسية المقايسة بالتألق الذاتي للمركب أو إخماد التألق الحيوي، مما يتطلب إجراء فحص مضاد متعامد.
الأسئلة الشائعة حول الصيدلة الحيوية
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:28
Coupling of Hsp90 C-Terminal Peptide to the Acceptor Beads
2:49
Assay for Interaction Between GST-FKBP51 or GST-FKBP52 and Hsp90 C-Terminal Peptide and Inhibition with Small Molecular Mass Compounds
4:14
Dose-Response Curve Generation and IC50 Calculation
4:58
Results: Inhibitory Effect of Small Molecular Weight Test Compound D10
5:59
Conclusion
