علم البصريات الحيوي 2.0: تسخير التلألؤ الحيوي لتنشيط البروتينات الحسية الضوئية في المختبر وفي الجسم الحي

1 (نغمات إلكترونية) علم البصريات Bioluminescent هو تقنية منصة يمكن من خلالها لمصادر الضوء المشفرة وراثيا تصور الوظائف والشبكات البيولوجية والتحكم فيها داخل الخلايا وفيما بينها. يصل التلألؤ الحيوي إلى كل مجال استشعار للضوء يتم التعبير عنه في مجموعة الخلايا المستهدفة دون أي تلف في الأنسجة والخلايا بواسطة الألياف البصرية والتعرض المادي المطول للضوء. للبدء ، ابدأ في إعداد مخزون Luciferin عن طريق إذابة خمسة ملليغرام من CTZ المجفف بالتجميد في 250 ميكرولتر من المذيب المعني.

ضمان حل CTZ على طول الجدران عن طريق السحب. أثناء حماية القارورة من الضوء المباشر ، قم بإعداد 50 ميكرولتر من الأليكوت في أنابيب أجهزة طرد مركزي سوداء 0.5 ملليلتر وتخزين الأليكوت عند 80 درجة مئوية تحت الصفر للاستخدام في المستقبل. قم بإجراء جميع عمليات التلاعب الإضافية في غرفة ضيقة خفيفة في غطاء محرك أقراص مضاء بالضوء الأحمر.

لإجراء تحفيز ضوء التلألؤ الحيوي الفردي ، قم بإعداد محلول عمل من Luciferin في وسط زراعة الخلايا ، قبل وقت قصير من إضافته إلى الخلايا بتركيز نهائي من 100 ميكرومولار. أضف الوسط المحتوي على اللوسيفيرين إلى الخلايا واحتضنه طوال المدة المطلوبة من التحفيز الخفيف. أطفئ الضوء الأحمر.

بعد الانتظار لبضع ثوان حتى تتكيف العيون مع الظلام الدامس ، راقب انبعاث الضوء بالعين. قم بتوثيق انبعاث الضوء عن طريق التقاط صورة. قم بإنهاء التحفيز الضوئي عن طريق استبدال الوسط المحتوي على لوسيفيرين بوسط الزرع ، ثم اغسل الخلايا بوسط الزرع مرة أو مرتين للقضاء على كل لوسيفيرين اعتمادا على حساسية التجربة.

لتجنب فقدان الخلايا ، قم بطبق الخلايا على أطباق مغلفة ب PDL واحتضن الخلايا. لإجراء التحفيز المتكرر لضوء التلألؤ الحيوي ، قم بإعداد غرفة تصوير الخلايا الحية عن طريق إنشاء حجرة ضيقة للضوء حول مجهر تصوير الخلايا الحية باستخدام صندوق وأوراق سوداء. تأكد من تغطية جميع مصادر الإضاءة الموجودة داخل الغرفة.

قم بإعداد نظام التروية مع الحل المطلوب للسحب وإخراج الغرفة مما يؤدي إلى حاوية نفايات. اعتمادا على عدد المحفزات المتكررة ، قم بتوصيل محلول تصوير Luciferin العامل المعد في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة. ضع غطاء مع خلايا منقولة في الغرفة.

أثناء الحفاظ على تشغيل المضخة، قم بإزالة أنبوب مدخل المضخة من وعاء السحب. اغمر أنبوب المدخل بسرعة في محلول Luciferin ، مع الحفاظ على وقت الانتقال قصيرا لتجنب أي فراغ هوائي في الأنابيب. بمجرد تناول محلول Luciferin ، ضع أنبوب المدخل مرة أخرى في كوب السحب.

كرر إزالة وغمر أنبوب المدخل في Luciferin عدة مرات حسب الحاجة على فترات من عدة دقائق إلى ساعات اعتمادا على النمط الفسيولوجي الذي من المفترض أن تتعرض له الخلايا. ثم احتفظ بالخلايا في بيئة محمية من الضوء لمدة 16 إلى 24 ساعة للنسخ أو المدة حتى يتم تقييم تأثير التحفيز الضوئي. لإجراء تنشيط التلألؤ الحيوي في الجسم الحي ، قم بإعداد Luciferin عن طريق إخراج قارورة CTZ من 80 درجة مئوية تحت الصفر ، ثم اتركها دافئة إلى درجة حرارة الغرفة في المنطقة المحمية من الضوء.

لكل قارورة تحتوي على 500 ميكروغرام من CTZ ، أضف 250 ميكرولتر من الماء المعقم باستخدام ماصة وضع السدادة المطاطية مرة أخرى على القارورة. احتضن القارورة الزجاجية المعاد تشكيلها في حمام مائي خفف من درجة حرارة 55 درجة مئوية لبضع دقائق لإذابة المسحوق تماما. انقل المحلول إلى أنبوب طرد مركزي أسود وشطف الجدران لاسترداد جميع CTZ.

بعد إزالة كمية المحلول اللازمة ، قم بتخزين المحلول المتبقي عند أربع درجات مئوية. بعد إعداد السيارة وإعادة تشكيلها واقتباسها بطريقة مماثلة ، قم بتشكيل تحفيز ضوء التلألؤ الحيوي عن طريق إزالة حجم Luciferin أو السيارة اللازمة لحجم الحيوان ومسار التطبيق المختار. حقن الحيوان مع Luciferin أو السيارة كما هو مصمم.

لتنشيط المؤتلف المطلوب خلال نموذج سلوكي معين ، قم بحقن الحيوان قبل الاختبار السلوكي مباشرة. للنسخ المرحلي ، حقن الحيوان مرارا وتكرارا على مدار أيام وجمع البيانات من الحيوان المحفز للتلألؤ الحيوي كما هو مصمم. سمح نظام التعبير السريع المنظم للضوء والنشاط بنسخ جين المراسل مع زيادة أيونات الكالسيوم داخل الخلايا والضوء.

أدى مؤشر LED الأزرق إلى تألق قوي للمراسل وتم تحديد تعبير FLuc من خلال قياسات التلألؤ بعد إضافة Luciferin. في نظام التصوير في الجسم الحي ، زاد كل من LED و CTZ بقوة من تعبير FLuc ، في حين أن وجود مكون عامل النسخ وحده أدى إلى إشارة خلفية كبيرة ، ربما بسبب التحلل البروتيني التلقائي. تم استخدام NanoLuc للتنظيم البصري من خلال DIMERIZATION CRI / CIB وعامل النسخ الحساس للضوء EL222.

كان التلألؤ الحيوي الناجم عن إضافة hCTZ إلى خلايا HEK-293 وإزالته بعد 15 دقيقة أكثر كفاءة من 20 دقيقة من التعرض LED ل CRI / CIB و EL222. لم تلاحظ فروق ذات دلالة إحصائية في فعالية النسخ بين النظامين عند نقلها المشترك مع hCTZ ، على الرغم من أن بروتينات الاندماج في CRI / CIB كانت أكثر كفاءة من EL222. أظهر CRY/CIB مستويات خلفية أعلى باستمرار مقارنة ب EL222 بغض النظر عن تركيز hCTZ.

تم اختبار التلألؤ الحيوي لكري كري المقسم الحساس للضوء على أساس بروتين VVD LOV iCreV. كشفت النتائج من تطبيق CTZ أن وجود CTZ زاد بقوة من التعبير على الخلفية ويشبه تطبيق LED. إن استخدام التلألؤ الحيوي لتنشيط ليس فقط المستقبلات الضوئية المتحركة للحديد ، ولكن أي مجالات حسية ضوئية تضيف بعدا آخر لتحفيز الضوء الذي يوسع التلاعب بوظائف الخلايا عبر المقاييس الزمنية والمكانية.

تم تطبيق علم البصريات الحيوي الوراثي في الخلايا والكائنات الحية النموذجية. يمكن تخصيص هذه البروتوكولات لاختبار مجموعة واسعة من الفرضيات الموجهة في المختبر وفي الجسم الحي.