تقييم توطين البروتين Submitochondrial في الخميرة الناشئة Saccharomyces cerevisiae
يوليو 19, 2021
على الرغم من التقدم الأخير، العديد من البروتينات الميتوكوندريا الخميرة لا تزال مع وظائفها غير معروف تماما. يوفر هذا البروتوكول طريقة بسيطة وموثوقة لتحديد توطين البروتينات في الخلايا الراسية، والتي كانت أساسية لتوضيح وظائفها الجزيئية.
تم تصميم هذا البروتوكول لتحديد توطين submitochondrial من بروتينات الميتوكوندريا الخميرة، والتي تعتبر خطوة أساسية خلال توضيح وظيفة البروتين الميتوكوندريا. البروتوكول مناسب لسلالات الخميرة لدينا الحفاظ عليها في ظروف النمو المختلفة. تمثل أداة قوية للبحث ودراسة الميتوكوندريا.
لتبدأ, سلسلة خلايا من مخزون الجلسرين المخزنة في 80 C, على لوحة أجار YPD لعزل مستعمرات واحدة من سلالة من الاهتمام. واحتضان لوحة في 30 C لمدة 2 إلى 3 أيام. إعداد ثقافة بداية عن طريق تلقيح 2 إلى 3 مستعمرات فردية من لوحة أجار YPD في قارورة Erlenmeyer 100 مل تحتوي على 10 إلى 30 مل من المتوسط YPGal.
احتضان القارورة في 30 C لمدة 24 ساعة مع اهتزاز قوي في 180 إلى 200 دورة في الدقيقة. تمييع ثقافة المبتدئين إلى 1 لتر من متوسط YPGal الطازج إلى كثافة بصرية أقل من 0.1 في 600 نانومتر. زراعة الخلايا في 30 C مع اهتزاز قوي في 180 إلى 200 دورة في الدقيقة لمدة 12 ساعة تقريبا، حتى تصل الكثافة البصرية 1 إلى 1.5.
تنفيذ عزل الميتوكوندريا تنقية عالية كما هو موضح في النص. وتحديد تركيز البروتين من إعداد الميتوكوندريا تنقية عالية، وذلك باستخدام المقايسة برادفورد، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. ضبط تركيز البروتين إلى 10 ملغ / مل مع الجليد الباردة SEM العازلة.
نقل 40 لتر من الميتوكوندريا عالية النقاء إلى أربعة 1.5 مل قبل المبردة والمسمي أنابيب الطرد المركزي الدقيق. إضافة 360 لتر من المخزن المؤقت SEM في الأنابيب الأولى والثانية. و 360 لتر من العازلة EM في الأنابيب الثالثة والرابعة.
باستخدام مخطط pipetting، وفقا للنص، إضافة 4 لتر من البروتين الطازج K في الأنبوب الثاني والرابع. بعد خلط جميع الأنابيب بلطف، احتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة مع خلط عرضية. لوقف نشاط البروتين K إضافة 4 لتر من 200 م م PMSF لجميع الأنابيب الأربعة.
الطرد المركزي الأنابيب في 20, 000 س غ لمدة 30 دقيقة في 4 C.وجمع supernatant, دون إزعاج بيليه, في أنبوب جديد 1.5 مل المبردة مسبقا المسمى الطرد المركزي. بعد ذلك ، resuspend بيليه في 400 لتر من الجليد الباردة SEM العازلة. لتثبيط الآثار المحتملة للبروتيناز K، يعجل الناطقات التي تم جمعها وإعادة إنفاق بيليه مع حمض ثلاثي الكلور إلى تركيز نهائي من 10٪ احتضان الأنابيب على الجليد لمدة 10 دقائق.
الطرد المركزي حمض ثلاثي الكلور الأسيتيك تعامل عينات لمدة 10 دقائق في 12، 000 x ز في 4 C.And بعد إزالة supernatant، resuspend بيليه في 200 لتر من العازلة عينة. إذا تحول اللون الأزرق بروموفينول الأصفر، إضافة 1 إلى 5 لتر من قاعدة تريس 1 M، حتى يتحول الأزرق. إضافة 4 لتر من 200 م م PMSF لجميع الأنابيب.
تخزين العينات في 80 C حتى مزيد من التحليل من قبل SDS-PAGE ولطخة الغربية. نقل 200 لتر من الميتوكوندريا تنقية عالية في أنبوب 1.5 مل قبل المبردة الطرد الدقيق. تمييع الميتوكوندريا مرة واحدة مع عازلة SEM الباردة الجليد.
باستخدام sonicator متوافقة مع وحدات التخزين الصغيرة، سونيكاتي الميتوكوندريا 3 مرات لمدة 30 ثانية على الجليد. طرد مركزي العينة لمدة 30 دقيقة في 100، 000 x ز في 4 C.وجمع supernatant في أنبوب جديد 1.5 مل قبل المبردة الطرد المركزي. بعد وضع علامة على الأنبوب باسم S "لجزء البروتين القابل للذوبان ، حافظ على الأنبوب على الجليد.
Resuspend بيليه من الخطوة السابقة في 400 لتر من الجليد الباردة SEM العازلة. نقل 100 لتر من بيليه resuspended في أنبوب جديد 1.5 مل قبل المبردة الطرد المركزي. تسمية أنبوب كما SMP "للجسيمات submitochondrial كسر، والحفاظ على أنبوب على الجليد.
تمييع المتبقية 300 لتر من بيليه resuspended مرة واحدة مع الطازجة أعدت 200 mM كربونات الصوديوم. واحتضان العينة المخففة على الجليد لمدة 30 دقيقة. ثم، طرد مركزي العينة لمدة 30 دقيقة في 100، 000 × ز في 4 C.Collect الناتة في أنبوب جديد 1.5 مل من أجهزة الطرد المركزي الصغيرة المبردة مسبقا.
تسمية العينة باسم CS "لكسر الكربونات الفائقة، والحفاظ على أنبوب على الجليد. Resuspend بيليه من الخطوة السابقة في 400 لتر من الجليد الباردة SEM العازلة. واسم العينة باسم CP "للكسر المرسب الكربونات.
عجل جميع العينات مع حمض ثلاثي الكلور إلى تركيز النهائي من 10٪واحتضان الأنابيب على الجليد لمدة 10 دقائق. ثم، الطرد المركزي العينات لمدة 10 دقائق في 12، 000 x ز في 4 C.After إزالة supernatant، resuspend كل بيليه في المخزن المؤقت العينة. إذا أصبح المخزن المؤقت عينة صفراء، إضافة 1 إلى 5 لتر من قاعدة 1 M تريس حتى يتحول إلى اللون الأزرق.
إضافة 1 لتر من 200 م م PMSF إلى جميع الأنابيب وتخزينها في 80 C حتى مزيد من التحليل من قبل SDS-PAGE ولطخة الغربية. تم تنقية كسر الميتوكوندريا الخام على الطرد المركزي المتدرجة كثافة السكروز، ولوحظ انخفاض في الملوثات الخلوية الأخرى. تم رصد الميتوكوندريا لتحويل mitoplast عن طريق اختفاء بروتين الفضاء بين الميمبران cytochrome b2 في بيليه.
مع المظهر المصاحب في الفائقة. وقد لوحظ تدهور البروتين K بوساطة من البروتين بين الميمبرين Sco1 بسبب اضطراب الغشاء الخارجي عن طريق الصدمة التناضحية. تم تأكيد سلامة غشاء الميتوكوندريا الخارجي من خلال حماية السيتوكروم B2 و Sco1 ضد تدهور البروتين K في جزء بيليه.
وبالمثل، أكدت حماية البروتين القابل للذوبان مصفوفة KGD سلامة الغشاء الميتوكوندريا الداخلية. Prx1 الشخصية لطخة الغربية اقترح توطين الميتوكوندريا المزدوجة في الفضاء intermembrane ومصفوفة. تعرضت الميتوكوندريا ل sonication واستخراج الكربونات للتحقيق في طوبولوجيا بروتينات الأغشية.
بقي البروتين الغشاء المتكاملة صب في الكسور بيليه. تم الكشف عن KGD في كسر فائقة. وكان الكشف عن بروتين KGD في بيليه بسبب الاختلافات معلمة سونيكيشن التي تؤثر على تشكيل الشركات الصغيرة والمتوسطة.
بعد معالجة كربونات الصوديوم ، تم تليين KGD وكسر SMP ووجد في الكسر الفائق. Prx1 الشخصية لطخة الغربية اقترح وجود ارتباط مع محيط الغشاء. لنجاح بروتوكول الكسر التقدي، من المهم وقف نشاط البروتين K بعد تورم هيبوتونيك عن طريق إضافة PMSF إلى العينات.
توفر المواقع معلومات حول توطين البروتين التقديمي. يمكن استخدام هذا البروتوكول أيضا للتحقق من سلامة الاستعدادات الميتوكوندريا ، وهو أمر أساسي أثناء الدراسات البروتيوميكية للأقسام الفرعية الميتوكوندريا.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تم تصميم هذا البروتوكول لتحديد التوطين تحت الميتوكوندريا لبروتينات الميتوكوندريا في الخميرة، وهو خطوة أساسية في توضيح وظائفها الجزيئية. إنه مناسب لسلالات الخميرة التي يتم الاحتفاظ بها تحت ظروف نمو مختلفة.
المكونات الرئيسية للدراسة
مجال العلم
- علم الأعصاب
- بيولوجيا الخلية
- البيولوجيا الجزيئية
الخلفية
- تمتلك العديد من بروتينات الميتوكوندريا في الخميرة وظائف غير معروفة.
- فهم توطين البروتين ضروري لتوضيح الوظيفة.
- يساعد هذا البروتوكول في دراسة بروتينات الميتوكوندريا.
- تعمل الخميرة ككائن نموذجي للدراسات الميتوكوندريا.
هدف الدراسة
- توفير طريقة موثوقة لتحديد توطين البروتين.
- تسهيل فهم وظائف بروتينات الميتوكوندريا.
- دعم البحث في بيولوجيا الميتوكوندريا.
الطرق المستخدمة
- تمديد الخلايا من مخزون الجلسرين على لوحات أجار YPD.
- تحضين الألواح عند 30°C لمدة 2 إلى 3 أيام.
- تحضير ثقافات البداية في وسط YPGal.
- عزل مستعمرات فردية لمزيد من التحليل.
النتائج الرئيسية
- العزل الناجح لمستعمرات الخميرة لدراسات توطين البروتين.
- تأسيس بروتوكول موثوق للتوطين تحت الميتوكوندريا.
- تسهيل المزيد من البحث في وظائف بروتينات الميتوكوندريا.
- تبيان قابلية البروتوكول للاستخدام عبر ظروف نمو مختلفة.
الاستنتاجات
- هذا البروتوكول هو أداة قوية للبحث في الميتوكوندريا.
- فهم توطين البروتين ضروري لتوضيح الوظيفة.
- يفتح أبوابًا للدراسات المستقبلية على بروتينات الميتوكوندريا.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
Accurate submitochondrial protein localization in Saccharomyces cerevisiae is critical for de-risking mitochondrial target validation and clarifying protein function in early discovery. This robust protocol enables precise mapping of protein topology, supporting predictive confidence in mitochondrial biology and facilitating risk-adjusted portfolio decisions. The method's reproducibility and quantitative outputs position it as a foundational capability for mitochondrial proteome characterization in biopharma R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional deconvolution of mitochondrial proteins by resolving suborganellar localization.
- Supports mechanistic de-risking by distinguishing matrix, intermembrane space, and membrane-associated proteins.
- Facilitates hypothesis-driven interrogation of mitochondrial pathways relevant to disease models.
- Provides a reference framework for comparative studies across yeast strains and growth conditions.
Screening & Assay Development
- Delivers validated mitochondrial preparations for downstream biochemical and proteomic assays.
- Standardizes subfractionation and protease protection workflows for reproducible localization data.
- Enables quantitative western blot readouts for assay calibration and benchmarking.
- Prepares robust input material for compound screening targeting mitochondrial compartments.
Translational & Preclinical Research
- Aligns yeast mitochondrial protein localization with translational biomarker discovery when disease relevance is established.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling cross-species localization comparisons.
- Reduces biological ambiguity in mitochondrial target selection for preclinical models.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates at the interface of early discovery and lead identification, providing foundational data for target validation and mechanistic studies in mitochondrial biology.
- Discovery Biology: Resolves protein localization and topology, informing pathway mapping and functional annotation.
- Screening: Supplies reproducible, quantitative localization data to support assay development and screening readiness.
- Analytics: Generates SDS-PAGE and western blot outputs for comparative analysis of protein distribution across mitochondrial subcompartments.
- Translational Research: Enables alignment of yeast mitochondrial protein data with higher-order models when relevant.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized workflow adaptable to diverse yeast strains and experimental conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in mitochondrial target validation and reduces mechanistic uncertainty.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and reproducible subfractionation and localization workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital allocation by clarifying mitochondrial protein function.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of mitochondrial targets and supports cross-program comparability.
Implementation Considerations
- Requires expertise in yeast mitochondrial isolation, subfractionation, and western blot analysis.
- Demands access to centrifugation, sonication, and proteomic instrumentation.
- Necessitates rigorous cross-team standardization of sample preparation and analytical protocols.
- Adaptable to various yeast strains and growth conditions with protocol optimization.
- Dependent on effective protease inhibition and fraction integrity for reliable localization data.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:33
Yeast Cells Growth
1:37
Isolation of Highly Purified Mitochondria
2:03
Sub-Mitochondrial Fractionation: Hypotonic Swelling Using Proteinase K
4:01
Sub-Mitochondrial Fractionation: Sonication and Carbonate Extraction
6:31
Results: Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae
8:14
Conclusion
