تقنيات تحضير الأنسجة للتصوير المقطعي المحوسب الجزئي المعزز بالتباين لنماذج قلب الثدييات الكبيرة المصابة بأمراض مزمنة
February 8th, 2022
هنا ، نقدم بروتوكولا للحصول على صور التصوير المقطعي المحوسب الدقيق عالية الدقة لقلوب الثدييات الكبيرة الصحية والمرضية مع تعزيز التباين الانتقائي للكولاجين.
يوفر هذا البروتوكول نظرة هيكلية دقيقة على الأمراض المرضية الهيكلية على نطاق الأعضاء بالكامل باستخدام التصوير المقطعي بالكمبيوتر الصغير. في هذا البروتوكول ، يتم تنفيذ طريقة متخصصة لإعداد الأنسجة لتحسين التصوير عالي الدقة لعينات القلب بالكامل من نماذج الثدييات الكبيرة الانتقالية في البشر مع تعزيز التباين الانتقائي للأمراض الهيكلية. البنية المجهرية للقلب مثل توزيع التليف وتنظيم عضلة القلب المثيرة تكمن وراء مجموعة واسعة من أمراض القلب وتمهد الطريق لعدم انتظام ضربات القلب الذي يهدد الحياة.
سيوضح الإجراء نيستور بالاريس لوبون ، خريج ما بعد الدكتوراه والدكتوراه في مختبري. للبدء ، قم بإعداد محلول قلبي يحتوي على هيبارين الصوديوم وتخزين المحلول عند أربع درجات مئوية. بعد ذلك ، قم بإعداد PBS / EDTA عن طريق إضافة EDTA أولا إلى لتر واحد من الماء المقطر للحصول على تركيز نهائي 10 ملليمولار.
ثم قم بزيادة والحفاظ على درجة الحموضة للمحلول عند 12 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم لإذابة EDTA. بمجرد إذابة EDTA بالكامل ، اخفض الرقم الهيدروجيني إلى 7.4 باستخدام حمض الهيدروكلوريك. ثم أضف كيسا واحدا من رقائق PBS للحصول على محلول مولاري 0.01 مع درجة الحموضة 7.4.
تخزين الحل المحضر في درجة حرارة الغرفة. أخيرا ، قم بإعداد محلول عامل تباين PMA للإيثانول بنسبة 1٪ عن طريق إضافة 10 غرامات من PMA إلى لتر واحد من الإيثانول المطلق. تخزين الحل المحضر في درجة حرارة الغرفة.
قم بإعداد خزان سعة لتر واحد مدعوم ب 80 سم فوق طبق تشريح ، وقم بإقران أنبوب بلاستيكي حراري بمنفذ تصريف الخزان. قم بإصلاح صنبور ثلاثي الاتجاهات على أنابيب الصرف الصحي وأنابيب بلاستيكية حرارية أخرى لكل منفذ مجاني على الصنبور ثلاثي الاتجاهات. إصلاح الصنابير ثنائية الاتجاه إلى الأطراف الحرة للأنابيب.
بعد ذلك ، املأ الخزان بمحلول القلب المستكمل بالهيبارين. افتح الصنابير للسماح للمحلول القلبي بتصريف إزالة جميع فقاعات الهواء. ثم أغلق الصنابير ثنائية الاتجاه.
بعد استخراج القلب من القتل الرحيم ، ضعه في محلول قلبي بارد مخزن على الجليد حتى يصبح جاهزا للتشريح. ثم قم بإعداد قنية للعظم التاجي الأيسر والأيمن عن طريق قطع خمسة سنتيمترات من أنابيب PTFE وتسخين أحد طرفيها عن طريق وضع الطرف بجوار لهب عار. بمجرد أن يبدأ ملليمتر واحد من الطرف في الذوبان ويصبح شفافا ، اضغط على الطرف ضد سطح مقاوم للحرارة الصلبة لتشكيل سلسلة من التلال عند طرف القنية لمنع القنية من الانزلاق من الأوعية ، ثم أدخل سنتيمترا واحدا من الطرف غير المسخن لكل قنية في طرفي أنبوب تصريف خزان التصريف.
بعد ذلك ، قم بإزالة قنية الأبهر وتوطين العظم الأيسر والأيمن للشرايين التاجية تحت محلول القلب البارد. باستخدام مقص مدبب ، افصل جذر الأبهر بعناية عن الأنسجة المحيطة فوق وأسفل عظم الشريان التاجي لتمكين خيوط خياطة حريرية بدون مقياس تحت الوعاء التاجي. ثم افتح الصنابير ثنائية الاتجاه وأدخل أطراف القنية في عظم الشريان التاجي.
مع امتداد أطراف القنية من سنتيمتر إلى سنتيمترين في العظم وخارج موضع الخياطة ، اربط الكانيولا. بعد ذلك ، شطف القلب أثناء تدليك البطينين بلطف لمدة 15 دقيقة حتى يتم تطهير القلب من الدم. بعد الشطف ، أغلق الصنابير ثنائية الاتجاه ، وافصلها عن الصنبور ثلاثي الاتجاهات وانقل القلب إلى حاوية بلاستيكية مقاومة للمواد الكيميائية سعة لتر واحد تحتوي على 500 ملليلتر من محلول PBS / EDTA.
أعد تدوير محلول PBS / EDTA في أنابيب اللدائن الحرارية تحت غطاء الدخان باستخدام مضخة تمعجية مع قناتين. قم بتوصيل أنبوب المضخة حتى تغيب الأنابيب عن فقاعات الهواء. ثم اطلع على كل قنية شريان تاجي عن طريق إعادة التدوير في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين بمعدل 80 ملليلتر في الدقيقة.
بعد التأكد من تشغيل غطاء الدخان ، أوقف المضخة ، واستنزف المحلول من الحاوية واستبدله ب 10٪ من الفورمالين للتثبيت لمدة ساعة واحدة عند 80 ملليلتر في الدقيقة. اطلع على القلب باستخدام سلسلة من تركيزات الإيثانول المتزايدة ، بدءا من 20٪ من الإيثانول لمدة لا تقل عن ثلاث ساعات. ثم استبدل الإيثانول 20٪ ب 30٪ إيثانول وبيرفيوز لمدة ساعتين.
استمر في التروية عن طريق زيادة تركيز الإيثانول في كل تكرار مع الحد الأدنى من التروية لمدة ساعة واحدة في كل تركيز. لتعزيز أنسجة القلب قبل التجفيف الهوائي ، أعد تدوير مزيج متساو من الإيثانول و HMDS لمدة 10 دقائق متبوعا ب HMDS بنسبة 100٪ لمدة ساعتين أخريين. أوقف مضخة التروية، ثم افصل القنية عن الأنبوب القلب من خياطة الأبهر داخل غطاء الدخان.
حرك كيس قفل بسحاب بعناية فوق القلب وأغلق ختم الكيس فوق الخيط لتقليل تعرض القلب للهواء المتداول. اترك القلب يجف من خلال التبخر لمدة أسبوع واحد. للحصول على عوامل تباين تحميل الانتشار، قم بإزالة الحقيبة.
اغسل القلب بنسبة 100٪ من الإيثانول لمدة 15 دقيقة مع الإثارة قبل غمره في 100٪ إيثانول مكمل ب 1٪ PMA لمدة 48 ساعة تحت الفراغ ، ثم قم بتغطية القلب بكيس قفل بسحاب كما هو موضح سابقا واتركه يجف. قم بتركيب القلب المجفف بالهواء على حامل عينات مناسب. لمنع أي حركة أثناء قياسات الأشعة السينية المقطعية الدقيقة، استخدم مشبكا مثبتا على حامل العينة وقم بتأمين القلب عبر الشريان الأورطي المجفف والصلب.
قم بتركيب حامل العينة في الماسح الضوئي المقطعي المحوسب الصغير. بعد ذلك ، افتح البرنامج وابدأ نظام التصوير المقطعي المحوسب للأشعة السينية الدقيقة. ثم اضبط الألومنيوم مرشح الأشعة السينية على ملليمتر واحد.
جهد مصدر الأشعة السينية إلى 60 كيلوفولت والتيار إلى 120 ميكروأمبير. بالإضافة إلى ذلك ، قم بتعيين أبعاد الصورة إلى 2،016 × 1،344 بكسل وحجم البكسل إلى 20 ميكرومتر. صور انتقال الأشعة السينية الكشفية على طول الدعم لتحديد مجال التصوير الكلي في الوصول الطولي للقلب.
للمسح الضوئي، استخدم خطوة دوران مقدارها 0.18 درجة، وإطارا يبلغ متوسطه خمس درجات، وعينة دوران 180 درجة عن طريق إلغاء تحديد خيار الحصول على 360 درجة. حدد وضع المسح الضوئي للإزاحة لتصوير عرض دعم العينة بالكامل. بعد المسح الضوئي ، استخدم البرنامج لإعادة البناء المقطعي لحجم صورة ثلاثي الأبعاد متساوي الخواص.
في النهاية ، استخدم تصحيح القطع الأثرية المتعلقة بالاستحواذ ، بما في ذلك تأثيرات تصلب الحزم بنسبة 10٪ وتقليل القطع الأثرية الحلقية من ثمانية. بعد ذلك ، باستخدام برنامج Data Viewer ، تصور مكدس البيانات المعاد إنشاؤه. قم بتوجيه العينة رقميا داخل حدود الصورة لإعادة محاذاة العينات ذات المحور الطويل والقصير مع المبدأ الثلاثة وهو محور حجم الصورة.
وأخيرا، اقتصاص حجم الصورة في جميع المحاور الثلاثة لإزالة طبقات الخلفية الخارجية للصورة وتقليل الحجم الإجمالي للصورة إلى أقصى حد. يظهر التصوير بالأشعة السينية لقلوب الخنازير المجففة بالهواء المعالم التشريحية الرئيسية بما في ذلك تجاويف البطين وجدار العضلات. أظهرت عمليات إعادة البناء المقطعي لأحجام الصور ثلاثية الأبعاد فصلا متميزا بين الأنسجة والخلفية عند الحدود الشرجية والشغاف.
أظهر تلطيخ ميسون ثلاثي الألوان تلطيخا إيجابيا للكولاجين في الطبقات الظهارية والبطانية بشكل شبه وعائي في الأنسجة تحت القلب. أظهرت إضاءة المجال الساطع تلوينا أغمق في هياكل الكولاجين بعد تلطيخ PMA ، مما يدعم التراكم التفضيلي ل PMA. كانت الصور الفلورية الملطخة ب PMA لأقسام الأنسجة البطينية تسبب في فقدان التألق الناجم عن PMA في مواقع الكولاجين.
عندما تكون عينة القلب ملطخة بعامل تباين عن طريق التروية قبل التجفيف الهوائي ، كشفت إعادة بناء الصورة عن تلطيخ غير مكتمل للغاية داخل حجرة عضلة القلب. علاوة على ذلك ، أظهرت الأنسجة منخفضة التباين انفصالا ضعيفا عن كثافة الخلفية. كشف التصوير المقطعي المحوسب الدقيق لجزء من الأغنام يعاني من احتشاء عضلة القلب المزمن عن آفة ليفية مركزية كثيفة محاطة بمنطقة حدودية فضفاضة وغير متجانسة.
يتم عرض أكبر كثافة إشارة لأحجام الصور المعاد بناؤها عند حدود الأنسجة ومناطق الندبة هنا. عوامل التباين تلطخ عضلة القلب الصحية بشكل سيئ ، ولكن تم الاحتفاظ بالتباين الهيكلي الصغير. في المنطقة الحدودية ، كان يتخلل النسيج الندبي عضلة القلب الباقية على قيد الحياة.
ظهر التليف الكثيف عبر الجدارية ولكنه محكم مما يشير إلى اختلافات في التكوين. أظهرت المنطقة البطينية اليسرى عبر الجدارية من إعداد الأنسجة الملطخة PMA تلطيخا انتقائيا للكولاجين وعدم تلطيخ في مناطق عضلة القلب الباقية على قيد الحياة. يوصى باستخدام الإيثانول مرات أطول في التروية لضمان التبادل الكامل لمحتوى الماء في القلب مع الإيثانول.
التفاعلات بين HMDS والماء تنتج الحرارة ، والتي قد تلحق الضرر بالعينة. ميزة قوية لهذا الإجراء هي القدرة على التحقق من صحة التصوير المقطعي المحوسب الدقيق باستخدام الأنسجة. يمكن تضمين العينات المجففة بالهواء مباشرة في البارافين لتقسيم التلطيخ والتصوير المجهري.
نظرة عامة
يوفر هذا البروتوكول تصويرًا عالي الدقة بالتصوير المقطعي المحوسب للقلب الكبير الصحي والمرضي للثدييات. يتضمن تعزيز التباين الانتقائي للكولاجين لتصور البنية المجهرية للقلب والأمراض المرتبطة به.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- تصوير القلب
- التصوير المقطعي المجهري
- التحليل المرضي
الخلفية
- فهم البنية المجهرية للقلب أمر بالغ الأهمية لتشخيص أمراض القلب.
- يمكن أن تؤدي الحالات المرضية إلى عدم انتظام ضربات القلب المهددة للحياة.
- تقنيات التصوير عالية الدقة ضرورية للتحليل التفصيلي.
- يستخدم هذا البروتوكول نماذج ثدييات كبيرة للبحث الانتقالي.
غرض الدراسة
- لتحسين تقنيات التصوير لعينات القلب الكاملة.
- لتعزيز تصور الأمراض الهيكلية باستخدام عوامل التباين.
- لتوفير رؤى حول توزيع التليف القلبي.
الطرق المستخدمة
- تحضير محلول التوقف القلبي وPBS/EDTA.
- استخدام عامل التباين PMA لتحسين التصوير.
- المسح المقطعي المجهري بمعايير تصوير محددة.
- تسريب الإيثانول المتسلسل للحفاظ على الأنسجة.
النتائج الرئيسية
- تصوير ناجح للبنية المجهرية للقلب في قلوب الثدييات الكبيرة.
- أظهرت فعالية تعزيز التباين الانتقائي للكولاجين.
- وفرت تصورًا مفصلًا للتليف والتنظيم العضلي القلبي.
الاستنتاجات
- يسمح البروتوكول بالتصوير عالي الدقة للأنسجة القلبية.
- يعزز فهم التغييرات الهيكلية في أمراض القلب.
- يمكن أن تساعد هذه الطريقة في تطوير استراتيجيات علاجية.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
This protocol enables high-resolution, non-destructive imaging of large mammalian hearts to visualize disease-related structural remodeling at microscale resolution. By selectively enhancing collagen-rich fibrotic tissue, it supports target validation and mechanistic de-risking in cardiovascular drug discovery. The approach bridges preclinical imaging with histopathological confirmation, improving predictive confidence in disease model relevance.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing fibrosis distribution and myocardial organization in disease models.
- Operational Value: Provides quantitative, spatially resolved structural data to clarify pathophysiological pathways.
- Predictive Value: Supports biological de-risking through direct visualization of target engagement with disease-modified tissue.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems with stabilized tissue conformation for reproducible downstream imaging workflows.
- Operational Value: Ensures assay standardization via air-dried, rigid heart samples suitable for longitudinal micro-CT monitoring.
- Scalability: Enables platform reuse across disease models (infarction, fibrillation) and species (pig, sheep) for comparative screening.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains disease relevance by preserving endogenous collagen distribution for biomarker-aligned structural analysis.
- Operational Value: Facilitates translational continuity from discovery through preclinical validation via correlative histology compatibility.
- Risk Mitigation: Supports risk-adjusted advancement decisions by enabling serial, non-destructive monitoring of structural disease progression.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through preclinical assessment, enabling iterative evaluation of structural disease modifiers in large mammalian models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by mapping fibrosis-surviving myocardium interfaces in chronic disease models.
- Screening: Delivers assay readiness through ethanol fixation and HMDS reinforcement, ensuring dimensional stability for high-resolution imaging.
- Analytics: Generates quantitative 3D volumetric readouts of contrast agent deposition, enabling objective comparison of fibrotic burden across conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical validation via direct correlation with histological staining (e.g., Mason’s trichrome) of the same air-dried samples.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging capability for longitudinal studies across multiple cardiac disease models and compound testing cycles.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in structure-function relationships underlying arrhythmogenic substrates.
- Operational Value: Delivers standardization and reproducibility through fixed tissue preparation and invariant imaging parameters (20.7 µm isotropic resolution).
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early, translatable structural biomarkers of disease severity and regression.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization through objective, imaging-based fibrosis quantification in preclinical models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cardiac dissection, perfusion techniques, and contrast agent handling.
- Depends on access to micro-CT scanners capable of sub-25 µm resolution and vacuum-compatible contrast loading.
- Necessitates cross-team standardization between imaging, histology, and pathology teams for correlative analysis.
- Involves adaptation considerations for varying heart sizes and disease-induced tissue fragility across models.
- Limited by perfusion duration requirements for complete ethanol exchange and contrast agent diffusion in large tissues.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:54
Solution Preparation
2:05
Tissue Preparation
5:21
Tissue Dehydration and Drying
6:57
MicroCT
9:20
Results: Contrast-Enhanced Air-Dried Tissue Preparations Enabled Microscale Imaging of Intact Large Mammalian Cardiac Models with Chronic Disease
11:36
Conclusion
