تطوير نموذج الزراعة المشتركة للخلايا لمحاكاة نقص تروية القلب / التروية في المختبر

تشير النتائج التي توصلنا إليها إلى أن تحسين البيئة المكانية للخلايا البطانية للخلايا القلبية العضلية المشتركة أمر ضروري لتوفير نموذج موات في المختبر لاختبار دور الخلايا البطانية في حماية الخلايا العضلية القلبية ضد إصابة إعادة التروية المحاكاة. تم استخدام نماذج الزراعة المشتركة للخلية على نطاق واسع للتحقيق في دور التفاعلات بين الخلية والخلية في وظيفة الخلية والتمايز. ومع ذلك ، فإن العلاجات المنفصلة بين أنواع الخلايا والتحليل النهائي لنوع خلية واحدة ليست ممكنة بسهولة في الثقافة المشتركة المختلطة.

تهدف الدراسة الحالية إلى إنشاء طبقتين خلويتين منفصلتين مع مسافة ذات مغزى بينهما حيث يمكن للمرء أن يحفز إصابة نقص الأكسجة ودراسة النتيجة والتأثيرات على نوع خلية واحدة. ابدأ التحضير عن طريق إذابة كلا الخطين الخلويين. قم بطلاء الخلايا في قوارير T25 بعد غسلها بوسائط جديدة.

في اليوم التالي ، قم بتحديث الخلايا بالوسائط واستخدمها عند التقاء. الحفاظ على حاضنة زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 21٪ من الأكسجين و 5٪ من ثاني أكسيد الكربون و 74٪ من النيتروجين. حافظ على رطوبةه.

تقدير التقاء خط خلية الخلايا العضلية القلبية تحت المجهر الضوئي. قم بإزالة الوسائط من القوارير التي تحتوي على مزارع الخلايا المتقاربة والتريبسين مع ثلاثة إلى خمسة ملليلترات من التربسين-EDTA لكل قارورة. حرك القارورة بلطف واحتضنها عند 37 درجة مئوية لمدة دقيقتين إلى خمس دقائق.

بعد ذلك ، قم بتقييم التقدم الأنزيمي تحت المجهر الضوئي. بعد الانفصال ، قم بتعطيل محلول التربسين عن طريق إضافة محلول التريسين أو الخلية إلى أنبوب 50 ملليلتر يحتوي على 10 ملليلتر من الوسائط لكل قارورة T25. الطرد المركزي لتعليق الخلية عند 120 × g لمدة دقيقتين للحصول على بيليه خلية ناعمة.

بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة supernatant وأعد تعليق الكريات في خمسة ملليلترات من الوسائط. بعد ذلك ، قم بإجراء عد الخلايا وتأكد من صلاحية الخلية. امزج و أليك 10 ميكرولترات من الخلايا المعاد تعليقها و 10 ميكرولترات من صبغة التربان الزرقاء ، ثم عد الخلايا الحية باستخدام عداد الخلايا.

تمييع الخلايا مع وسائط منتظمة جديدة لتحقيق كثافات البذر المطلوبة. خذ صفيحة من 24 بئرا قبل تغطيتها بمصفوفة خارج الخلية وخلايا عضلية قلبية صفيحية بكثافات بذر 300،000 لكل بئر في الجزء السفلي من اللوحة. الحفاظ على الخلايا في 37 درجة مئوية مع 5٪ من ثاني أكسيد الكربون بين عشية وضحاها.

بعد 24 ساعة ، يتم إدخال الخلايا البطانية في الإدخالات بكثافة طلاء مثالية تبلغ 100،000 لكل إدراج. بعد 24 ساعة من طلاء الخلايا البطانية، ضع إدخالات الخلايا البطانية داخل آبار الخلايا العضلية القلبية وابدأ الزراعة المشتركة. اسمح للخلايا بالزراعة المشتركة لمدة 12 إلى 24 ساعة قبل إجراء التجارب.

تحضير وسائط نقص الأكسجة عن طريق صب ما يقرب من 25 ملليلتر من الوسائط في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر. قم بإغلاق الجزء العلوي بالهواء باستخدام غشاء سيليكون واستخدم ماصة معقمة لثقب ثقب. بعد ذلك ، قم بإنشاء ثقب آخر واترك ما يقرب من 2/3 من الماصات مغمورة في الوسائط.

اغسل الوسائط بغاز نقص الأكسجة لمدة خمس دقائق بمعدل تدفق 30 لترا في الدقيقة ، ثم تخلص من وسائط الألواح المكونة من 24 بئرا أو إدخالات الثقافة التي تحتوي على خلايا متصلة. اغسلها بلطف شديد مع 100 ميكرولتر من 10٪ PBS لكل بئر أضف 500 ميكرولتر من وسائط نقص الأكسجين الطازجة إلى كل بئر من الألواح أو الإدراجات. استبدل الوسائط الأصلية بوسائط طبيعية جديدة تحتوي على الجلوكوز والمصل في مجموعة التحكم المعيارية.

ضع طبق بتري مملوءا بالماء المعقم في غرفة نقص الأكسجة لترطيب الغرفة. ثم ضع الألواح التي تحتوي على مجموعات نقص الأكسجة في الغرفة. اغسل غرفة نقص الأكسجة بغاز نقص الأكسجة لمدة خمس دقائق بتدفق 30 لترا في الدقيقة.

بعد ذلك ، ضع الغرفة داخل حاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. بعد نقص الأكسجة ، تخلص من الوسائط القديمة للألواح أو الإدخالات وأضف 500 ميكرولتر من الوسائط العادية التي تحتوي على الجلوكوز والمصل إلى كل جدار من جدران الألواح ، ثم قم بتخزين الألواح داخل حاضنة تحت ظروف الثقافة العادية لمدة ساعتين لتقليد التروية. انقل وسائط زراعة الخلايا من صفيحة 24 بئرا إلى صفيحة 96 بئرا ، ثم خذ 200 ميكرولتر من الوسائط من كل بئر من الصفيحة المكونة من 24 بئرا ووزعت بالتساوي على أربعة آبار من صفيحة 96 بئرا.

قم بقياس امتصاص LDH باستخدام مجموعة فحص السمية الخلوية في صفيحة 96 بئرا واتبع تعليمات الشركة المصنعة لتحديد درجة الإصابة الخلوية. في هذه الدراسة ، تم تقييم ثلاثة أنواع من الإدراجات. جميع الإدخالات الثلاثة لها نفس حجم المسام البالغ 0.4 ميكرومتر.

كان الفرق الوحيد بينها هو الإدراج إلى ارتفاع القاعدة ، مما يسمح للمسافات بين طبقتي الخلايا المستزرعتين معا بأن تكون 0.5 و 1.0 و 2.0 ملم. باستخدام هذا البروتوكول ، تم استزراع الخلايا في ظل ظروف الأكسجين الطبيعية ثم تم تقسيمها إلى مجموعتين مجموعة التحكم المعيارية ومجموعة نقص الأكسجة. بعد 24 ساعة ، تم تحديث كلتا المجموعتين بالوسائط وزراعتهما في ظل ظروف الأكسجين العادية لمدة ساعتين أخريين قبل إجراء اختبارات نقطة النهاية.

تظهر هنا مقارنة بين الأنواع الثلاثة من إدراج الثقافة في تقييم إطلاق نازعة هيدروجيناز اللاكتات للخلايا العضلية القلبية وحدها ، والخلايا البطانية وحدها ، والزراعة المشتركة للخلايا العضلية القلبية مع الخلايا البطانية تحت ظروف إعادة الأكسجين المعيارية ، ونقص الأكسجة فقط ، ونقص الأكسجة. مع مسافة 0.5 ملليمتر بين طبقات الخلايا ، أدى نقص الأكسجة إلى زيادة كبيرة في إطلاق LDH مقارنة ب normoxia عندما تم استزراع الخلايا العضلية القلبية وحدها. ومع ذلك ، تم زيادة LDH بشكل طفيف فقط في مجموعة إعادة أكسجين نقص الأكسجة مقارنة بمجموعة نقص الأكسجة فقط.

عندما تم زراعة الخلايا البطانية والخلايا العضلية القلبية معا ، لم يتم تخفيف زيادة إطلاق LDH في ظل ظروف نقص الأكسجة فقط. هذا يشير إلى أن الخلايا البطانية لم يكن لها أي تأثير وقائي مقارنة بمجموعة الخلايا العضلية القلبية وحدها في ظل ظروف نقص الأكسجة فقط. ومع ذلك ، مارست الخلايا البطانية حماية خفيفة ولكنها كبيرة على الخلايا العضلية القلبية أثناء الموارد البشرية. عندما كانت المسافة بين طبقات الخلايا ملليمتر واحد ، زاد إطلاق LDH أيضا بشكل كبير في الخلايا العضلية القلبية فقط تحت شرط نقص الأكسجة فقط.

ومع ذلك ، على عكس إدراج 0.5 ملم ، تم تعزيز زيادة LDH في الخلايا العضلية القلبية فقط بواسطة HR على حالات نقص الأكسجة فقط. كانت هذه الزيادة أكثر وضوحا مع إدراج مليمترين. تمت معايرة تركيز الخلايا البطانية المطلية في إدخالين ملليمتريين إلى 25،000،50،000 و 100،000 خلية لكل إدراج ، على التوالي.

وقد وجد أن زيادة كثافة الخلايا البطانية في الزراعة المشتركة أدت إلى تخفيف يعتمد على الجرعة من إطلاق LDH الناجم عن الموارد البشرية. ومع ذلك ، لم يلاحظ أي تأثير من هذا القبيل في ظل الظروف المعيارية. لا تقتصر منهجية الزراعة المشتركة هذه على الخلايا البطانية والخلايا العضلية القلبية. يجب أن تساعد هذه الطرق في التحقيق في تفاعلات محددة بين الخلايا الخلوية بين خطوط الخلايا المتنوعة عبر أعضاء متعددة ذات أهمية.