تلطيخ الفلورسنت المناعي متعدد الخلايا المناعية من أربعة أنواع من الخلايا المناعية بطانة الرحم في الإجهاض المتكرر
أغسطس 4, 2021
على الرغم من التقدم في الكيمياء المناعية المتعددة والتصوير متعدد الأطياف ، فإن توصيف كثافة وتتجمع الخلايا المناعية الرئيسية في وقت واحد في بطانة الرحم لا يزال يشكل تحديا. تصف هذه الورقة بروتوكول تلطيخ متعدد المضاعفات مفصل وتصوير للتوطين المتزامن لأربعة أنواع من الخلايا المناعية في بطانة الرحم.
التكنولوجيا الحالية تسمح باستخدام الأجسام المضادة التي أثيرت في نفس النوع للكشف عن ما يصل إلى سبع علامات. إثبات الإجراء سيكون لوسيا تشان، فني من المختبر. تبدأ بإعداد شرائح زجاجية ثابتة البارافين ثابتة المضمنة التي شنت مع عينة الأنسجة، عن طريق وضع الشرائح شقة في الفرن، لخبز في 60 درجة مئوية مع الأنسجة التي تواجه صعودا.
بعد ساعة واحدة، إزالة الشمع وإعادة ترطيب الشرائح في كل 10 دقائق مع سلسلة من المواد الكيميائية، كما هو موضح في المخطوطة. غمر الشرائح في المالحة ثلاثية المخزنة مؤقتا، ومن ثم في مربع الشريحة البلاستيكية مليئة خليط من الفورمالديهايد المخفف في الميثانول، لإصلاح العينات. بعد ذلك، اغسل الشرائح مرتين في ماء مأين لمدة دقيقتين.
انتقل إلى استرجاع epitope، عن طريق وضع رف الشرائح في مربع مقاومة للحرارة مليئة عازلة حمض الستريك في درجة الحموضة 6.0. ثم وضع الصندوق في الميكروويف، لتسخين الشرائح أولا بقوة 100٪ لمدة 50 ثانية، تليها 20 دقيقة بقوة 20٪، للحفاظ على نفس درجة الحرارة. بعد شطف الشرائح في الماء المقطر، والغسيل مع TBST، تزج الشريحة في جرة تحتوي على محلول حجب البيروكسيد لمدة 10 دقائق.
بعد الحضانة، شطف الشرائح في الماء المقطر وغسل مع TBST، ثم استخدام قلم حاجز مسعور لوضع علامة على الحدود حول قسم الأنسجة على الشريحة. ثم شطف الشريحة في TBST، وتغطية أقسام الأنسجة مع العازلة حجب واحتضان الشرائح في غرفة رطبة لمدة 15 دقيقة. لإزالة الكواشف الحجب، أولا احتضان الشرائح مع الأجسام المضادة الأولية ذات الفائدة، ومن ثم إزالة الأجسام المضادة الأولية عن طريق غسل الشرائح ثلاث مرات مع TBST، قبل الحضانة مع البوليمر الفجل peroxidase المسمى، الأجسام المضادة الثانوية.
بعد الحضانة ، اغسل الشرائح قبل تطبيق نباتات Opal على حل عمل TSA ، ثم شطف الشريحة بحاجز استرداد المستضد. قم بإجراء التجريد القائم على الميكروويف عن طريق تسخين الشرائح في مخزن استرجاع المستضد في ميكروويف بقوة 100٪، لمدة 50 ثانية، يليه 20٪ طاقة لمدة 20 دقيقة في حاويات الميكروويف الآمنة. بعد تبريد العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة، شطف الشرائح في الماء المقطر وTBST واحتضان في وقت لاحق مع محلول دابي لمدة خمس دقائق.
ثم الهواء الجاف الشريحة قبل تصاعد مع المتوسطة تركيب المناسبة. قبل تصوير الشرائح مسبقا، يتم ضبط عوامل التصفية المناسبة في محطة العمل. التقاط ما لا يقل عن 10 حقول للتحليل تحت التكبير 200 مرة.
لحساب الخلايا، انقر فوق زر عدد الكائنات في شريط الخطوة، لعرض لوحة إعدادات عد الكائنات. إذا تم تقسيم الأنسجة، حدد فئة الأنسجة التي يمكن العثور على الكائنات فيها. ثم حدد الإشارة المطلوبة من مقياس تلقائي أو مقياس ثابت.
لتقسيم الكائن، حدد المكون الأساسي من القائمة المنسدلة. للكشف عن الكائنات التي تلمس كائنات أخرى ككائنات فردية وغير مجمعة، تحقق من الحد الأقصى لحجم مربع وبكسل ثم اختر تقسيم المكرر. بعد ذلك، عد جميع الخلايا اللحمية في الخلايا المناعية بشكل منفصل، للتعبير عن البيانات كنسب مئوية من الخلايا المناعية بالنسبة إلى العدد الإجمالي للخلايا سترومال لكل صورة القبض.
في وقت لاحق، تقرير عدد الخلايا النهائي كمتوسط لكافة الحقول. باستخدام محرر طريقة العرض، قم بفحص جداول البيانات الناتجة بعد المعالجة ثم قم بتصدير جدول بيانات العد. في التحليل التمثيلي، أربعة أنواع من الخلايا المناعية في عينة بطانة الرحم نحن متمايزون.
تظهر الصورة المعالجة تقسيم الأنسجة كمقصورات ظهارية وسترومية. تم إجراء الإصابة بأمراض مناعة متعددة على خزعات بطانة الرحم من امرأة مراقبة خصبة وامرأة مع إجهاض متكرر غير مبرر ، تم الكشف عن طابق واحد بالنسبة لنا يمثل CD3 و CD56 و CD68 و CD20 في التخميد المناعي. بمجرد تحديد الصوت المناعي ، يمكن أن يساعد المزيد من التلطيخ تحت السيتوكين في معالجة تفاعلهم وآلية نجاح الزرع.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تتناول هذه الدراسة تحديات التوصيف المتزامن لكثافة وتجمع الخلايا المناعية الرئيسية في بطانة الرحم باستخدام الكيمياء النسيجية المناعية متعددة الإرسال والتصوير متعدد الأطياف. ويصف البحث بروتوكول صبغ تفصيلي لتحديد الموقع المتزامن لأربعة أنواع من الخلايا المناعية في بطانة الرحم.
المكونات الرئيسية للدراسة
مجال البحث
- علم المناعة
- بيولوجيا بطانة الرحم
- تقنيات التصوير المتعدد
خلفية علمية
- أهمية توصيف الخلايا المناعية في البيولوجيا التناسلية.
- التحديات في طرق التلوين التقليدية.
- التطورات في تقنية التصوير.
الطرق المستخدمة
- الكيمياء النسيجية المناعية متعددة الأهداف
- عينات نسيجية مثبتة بالفورمالين ومطمورة في البارافين
- التصوير متعدد الأطياف
النتائج الرئيسية
- تم التمييز بنجاح بين أربعة أنواع من الخلايا المناعية (CD3, CD56, CD68, CD20) في بطانة الرحم.
- تم تصور توزيع الخلايا المناعية وتجمعاتها.
- تم تقديم تحسينات في البروتوكول من أجل الدراسات المستقبلية.
الاستنتاجات
- توضح الدراسة طريقة موثوقة لتحليل الخلايا المناعية في بطانة الرحم.
- ولهذا الأمر تداعيات على فهم الصحة الإنجابية ونجاح الانغراس.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
يتيح التلوين الكيميائي النسيجي المناعي الفلوري المتعدد القياس الكمي المتزامن لمجموعات متعددة من الخلايا المناعية داخل مقطع نسيجي واحد، مما يعالج فجوة حرجة في أبحاث المناعة التكاثرية. ويدعم هذا النهج تقليل المخاطر الميكانيكية للفرضيات المتعلقة بالبيئة الدقيقة لبطانة الرحم من خلال توفير بيانات توصيف مناعي متعددة ومحددة مكانيًا مستمدة مباشرة من عينات المرضى. كما تعزز هذه الطريقة الثقة التنبؤية في جهود التحقق من الأهداف المتعلقة بفشل الانغراس والإجهاض المتكرر عن طريق تمكين المقارنة المباشرة لكثافة الخلايا المناعية وتكتلها بين الحالات الخصبة والحالات المرضية.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية البيولوجية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: يتيح استقصاء الفرضيات العلاجية المتعلقة بتفاعلات الخلايا المناعية في بطانة الرحم من خلال الكشف المتزامن عن واسمات CD3 وCD56 وCD68 وCD20.
- القيمة التشغيلية: يقلل من الحاجة إلى التقطيع والتصبيغ المتسلسل، مما يحافظ على العينات السريرية الثمينة مع زيادة كثافة البيانات لكل مقطع نسيجي.
- الثقة التنبؤية: يوفر مقاييس كمية ذات دقة مكانية للخلايا المناعية، مما يدعم الحد من المخاطر البيولوجية للأهداف المشاركة في التواصل المناعي لبطانة الرحم أثناء الانغراس.
الفحص وتطوير المقايسة
- جاهزية المقايسة: تُنتج قراءات فلورية معيارية وقابلة للتكرار، ومناسبة لمنصات التصوير عالية المحتوى ومسارات تحليل الصور الآلية.
- القابلية للتوسع: متوافقة مع البنوك الحيوية للأنسجة المثبتة بالفورمالين والمطمورة في البارافين (FFPE)، مما يسمح بالتحليل الاسترجاعي لمجموعات كبيرة من العينات لاكتشاف المؤشرات الحيوية.
- تحسين التعددية: تعالج تداخل الفلوروفورات من خلال دورات الصبغ والإزالة المتتالية، مما يضمن خصوصية الإشارة لكل مؤشر من مؤشرات الخلايا المناعية.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- النظام ذو الصلة بالمرض: قابل للتطبيق مباشرة على خزعات بطانة الرحم البشرية، مما يوفر نموذجاً ذا صلة سريرياً لدراسة الخلل في التنظيم المناعي في حالات الإجهاض المتكرر.
- الاستمرارية الانتقالية: يربط بين مرحلة اكتشاف التوصيف المناعي والتحقق قبل السريري من خلال تمكين التوصيف النمطي المناعي المتسق عبر أنواع العينات المختلفة.
- تقليل المخاطر الميكانيكية: يدعم استقصاء التفاعلات بين الخلايا المناعية التي تتوسطها السيتوكينات بعد التحديد الأولي لنوع الخلية، مما يسهل التحقق من الأهداف على مستوى المسارات الحيوية.
تكامل سير العمل والمسارات التحليلية
تندرج هذه الطريقة ضمن مرحلة بيولوجيا الاكتشاف، وبالتحديد في دعم جهود التحقق من الأهداف المناعية والفحص المظهري في برامج المناعة التناسلية.
- بيولوجيا الاستكشاف: تتيح اختبار الفرضيات المتعلقة بتكوين الخلايا المناعية والتنظيم المكاني في بطانة الرحم خلال نافذة الانغراس.
- الفحص: تُنتج مخرجات كمية من التألق المناعي تسمح بمقارنة كثافات الخلايا المناعية وأنماط تكتلها عبر الظروف التجريبية المختلفة.
- التحليلات: توفر بيانات مجمعة لشدة التألق والتوضع المشترك، مما يساعد في تحديد النمط الظاهري للخلايا المناعية واستنتاج حالتها الوظيفية.
- الأبحاث الانتقالية: تدعم الاستمرارية من تحليل العينات البشرية إلى الدراسات الميكانيكية اللاحقة من خلال توفير مؤشرات خلوية مناعية تم التحقق من صحتها للاختبارات الوظيفية اللاحقة.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: تؤسس لمنصة صبغ مناعي قابلة لإعادة الاستخدام وتطبيقها في دراسات متعددة للتنميط المناعي في بطانة الرحم والأنسجة الأخرى.
الأثر التشغيلي وأثر المؤسسة
- القيمة العلمية: تزيد من الثقة التنبؤية في التحقق من الأهداف من خلال تمكين المقارنة المباشرة والمتعددة لمجموعات الخلايا المناعية في الأنسجة المصابة مقابل الأنسجة الضابطة.
- القيمة التشغيلية: تحسن كفاءة الكواشف وتقلل من التباين من خلال بروتوكولات التلوين والإزالة المتسلسلة والمحسنة على شرائح مفردة.
- القيمة الاستراتيجية: توفر معلومات لاتخاذ قرارات المضي قدماً أو التوقف في العلاجات التناسلية عن طريق توضيح مساهمات البيئة الدقيقة المناعية في نجاح أو فشل الانغراس.
- التأثير على مجموعة المشاريع: تتيح ترتيب أولويات الأهداف وفقاً للمخاطر بناءً على كثافة الخلايا المناعية، وتكتلها، والارتباط المكاني مع المقصورات الظهارية أو السدوية.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في الكيمياء النسيجية المناعية، والمجهر الفلوري، وتحليل الصور متعددة الأطياف لضمان دقة الكشف عن الإشارات وتقديرها كمياً.
- يعتمد على توفر أنظمة استعادة المستضدات القائمة على الميكروويف، وماسحات الشرائح القادرة على التصوير الفلوري، وأطقم فلوروفور Opal المعتمدة لإجراء دورات التعدد.
- يستلزم توحيد معايير عمليات الحجب، وحضانة الأجسام المضادة، وظروف الإزالة (stripping) بين المختبرات لضمان تكرار نتائج التعدد.
- يتطلب تكييف مجموعات الأجسام المضادة وخطوات التحقق عند تطبيق الطريقة على أنواع مختلفة من الأنسجة أو واسمات الخلايا المناعية الأخرى بخلاف CD3 وCD56 وCD68 وCD20.
- تشمل القيود العملية احتمال حدوث تداخل في الفلوروفورات (bleed-through) والحاجة إلى فصل طيفي دقيق أثناء التصوير، وهو ما يتم معالجته من خلال الإزالة المتسلسلة وإعدادات الفلتر المعتمدة.
