التحليل الطيفي المزدوج اللون للفلورسين المترابط لدراسة التفاعل بين البروتين والبروتين وديناميكيات البروتين في الخلايا الحية

نقدم بروتوكول تجريبي وسير عمل تحليل البيانات لأداء الخلية الحية المزدوجة اللون مضان عبر التحليل الطيفي الارتباط (FCCS) جنبا إلى جنب مع Förster الرنين نقل الطاقة (FRET) لدراسة ديناميات مستقبلات الغشاء في الخلايا الحية باستخدام تقنيات وضع العلامات الفلورية الحديثة.

مضان عبر الارتباط الطيفي هو وسيلة إحصائية تستخدم مضان نتيجة الوقت لتحديد التوقيع الديناميكي لمستقبلات G المقترنة بالبروتين في الخلايا الحية. هنا، ونحن مهتمون بشكل خاص، في مستقبلات بيتا-2 الأدرينالية. مستقبلات Sphingolipid أساسا توفير المعلومات حول ديناميات الانتشار الترجمي وبمساعدة من anisotropy مضان أيضا نشر التناوب.

من خلال إدخال تسمية إضافية ، يمكننا أيضا إجراء تغييرات مؤيدة للربط أو حتى تشكيلية إذا عززت نقل الطاقة بالرنين بين التسميات كما تم فحصها. يتطلب الوقت الكمي المحلول الفلورسينس محاذاة دقيقة لقياسات الإعداد والمعايرة. في الدقائق التالية، سوف نقدم دليلا تجريبيا للطيف ارتباط مضان خلايا الحياة، عبر التحليل الطيفي الارتباط، ونقل الطاقة الرنين فورستر من مستقبلات G البروتين مقرونة، وذلك باستخدام استنساخ قادرة على العلامات وقوة التدفق الاصطناعية.

يجب إجراء الجلوس في الخلايا ونقلها في ظل ظروف معقمة. وضع جرس زلة غطاء نظيف على لوحة ثقافة البئر ستة، وغسله مع العازلة الفوسفات العقيمة المالحة إضافة اثنين مل من الخلايا المتوسطة الثقافة مع فينول الأحمر تكملها 10٪ مصل البقر الجنين، 100 ميكروغرام، لكل البنسلين أمين و 100 ميكروغرام لكل مل ستربتوميسين إلى كل بئر، ويبقيه جانبا. تأخذ الخلايا CHO التي يتم استزراعها في نفس الوسط مع فينول الأحمر في 37 درجة مئوية في ثاني أكسيد الكربون خمسة في المئة وغسلها مع خمسة مل برنامج تلفزيوني لإزالة الخلايا الميتة.

إضافة اثنين مل من التريبسين واحتضان لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة. تمييع خلايا البيانات مع ثمانية مل من المتوسط مع فينول الأحمر وتخلط بعناية عن طريق pipetting. عد الخلايا في غرفة نيوباور والجلوس الخلايا في كثافة 150،000 خلية لكل بئر في لوحة ثقافة البئر الستة التي تحتوي على زلة الغطاء.

دع الخلايا تنمو في حاضنة لمدة 24 ساعة من أجل تحقيق التقاء 80٪ تقريبا. تمييع اثنين ميكروغرام من الحمض النووي المتجه المطلوب. على سبيل المثال، CT SNAP أو NT SNAP، وستة ميكرولتر من كاشف العدوى هذا في أنبوبين منفصلين.

كل تحتوي على 500 ميكرولتر انخفاض متوسط المصل لكل بئر واحتضانها لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. امزج الحلين معا للحصول على خليط العدوى واحتضانه لمدة 20 دقيقة أخرى في درجة حرارة الغرفة. في غضون ذلك، غسل خلايا CHO يجلس مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني عقيمة.

استبدال برنامج تلفزيوني مع مل واحد لكل بئر من فينول الأحمر المتوسطة الحرة, تستكمل مع 10٪ مصل البقر الجنينية وليس المضادات الحيوية. إضافة خليط البناء بأكمله من قطرة واحدة مل الحكمة إلى كل بئر واحتضان الخلايا بين عشية وضحاها في 37 درجة في خمسة في المئة CO2. لوضع العلامات، تمييع الركيزة SNAP المناسبة في وسط مل واحد تكملها مصل البقر الجنيني 10٪ للحصول على تركيز نهائي من ميكرومولار واحد.

غسل الخلايا المصابة مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني وإضافة مل واحد لكل بئر من محلول واحد MICROMOLAR SNAP الركيزة. احتضان الخلايا لمدة 20 دقيقة في 37 درجة في خمسة في المئة CO2. غسل الخلايا ثلاث مرات مع فينول الأحمر المتوسطة الحرة، وإضافة اثنين مل لكل فينول جيدا المتوسطة الحرة الحمراء.

احتضان الخلايا لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية في 5 في المئة CO2. نقل زلة غطاء من جميع العينات في وقت لاحق في غرفة التصوير وغسل مع 500 ميكرولتر التصوير العازلة. إضافة 500 ميكرولتر التصوير المخزن المؤقت قبل الانتقال إلى الإعداد فريد FCS.

تم تجهيز إعداد FRED FCS بهدف مياه المجهر confocal ، واثنين من خطوط الليزر ، ونظام عد أجنبي واحد للحاف الزمني ، واثنين من BMTs الهجين ، وأسهمين لجمع الفوتون وبرامج جمع البيانات. من المهم جدا محاذاة الإعداد في كل مرة قبل القياس في الخلايا الحية. لضبط التركيز، الثقب ووضع التلوين، ضع اثنين من محلول المعايرة الخضراء نانومولار على زلة غطاء زجاجي والتبديل على الليزر نانومتر 485 و 560 نانومتر تعمل في أكوام، الإثارة بين الشقوق أو وضع PI.

التركيز على الحل وضبط الثقب وطوق موقف حلقة بحيث يتم الحصول على أعلى معدل العد وأصغر حجم confocal للحصول على أقصى قدر من السطوع الجزيئي. كرر هذه العملية للقنوات الحمراء مع 10 نانومولار حل المعايرة الحمراء وخليط من كليهما. ضع 10 نانومولار حل الحمض النووي على زلة غطاء الزجاج، وضبط تركيز الثقب وموقف حلقة طوق بحيث الألوان المتقاطعة بين قنوات الكشف الأخضر والأحمر هو أعلى.

هذا هو المصدر أعلى السعة. للقياسات في الخلايا الحية، ابحث عن خلية مناسبة عن طريق الحد من مصباح العلامة والمراقبة من خلال العين. قم بتشغيل كل من الليزر في وضع PI وركز على الغشاء من خلال البحث عن أقصى عدد ممكن في الثانية.

يرجى ملاحظة أن طاقة الليزر قد تحتاج إلى تقليل لعينات الخلية. ويفضل أن يكون أقل من خمسة ميكروواط في الهدف. هذا يعتمد اعتمادا كبيرا على الأزهار المستخدمة والإعداد.

مراقبة السيارات وعبر المنحنيات كول من بيتا-2 AR ملزمة جنيه والمفاجئة تحقيقات العلامة في المعاينة عبر الإنترنت من برنامج جمع البيانات وجمع العديد من القياسات الفرز مع وقت الاستحواذ بين 60 إلى 180 ثانية. تصدير مسار الارتباط والتباين من جميع القياسات. يرجى الحرص هنا لتحديد الإطارات الوقت السريع والتأخير بشكل صحيح واستخدام بعض الوقت الجزئي الحصول على الخيار في برنامج ارتباط البيانات.

في المجموع، هناك حاجة إلى ثلاثة ارتباطات مختلفة. الارتباط التلقائي للنافذة الزمنية موجه القناة الخضراء. الارتباط التلقائي للقنوات الحمراء ونافذة وقت التأخير.

وأخيرا كان الارتباط المتبادل لإشارة القناة الخضراء، والنافذة الزمنية السريعة هي إشارة القناة الحمراء في نافذة وقت التأخير. وهنا وظائف الارتباط التلقائي للفريد الأخضر والأحمر للحلول وتناسبها لنموذج نشر DT 3 مع مصطلح ثلاثي إضافي من المطلوب لمعايرة شكل وحجم حجم الكشف عن كونفوجال لاثنين من استخدام قنوات اللون، حيث B هو خط الأساس للمنحنى وعدد من الجزيئات والتركيز، TD وقت الانتشار و S، الصفر على أوميغا صفر عامل شكل عنصر حجم confocal. يوصف الوميض الثلاثي وفيزياء الصور بأنها سعة AR ووقت الاسترخاء TR. استخدام معامل الانتشار المعروف للمعايرة الخضراء والحمراء تبرز والحصول على عوامل الشكل لتحديد أبعاد وحجم عنصر حجم الكونفوجال المعدية.

احسب الطيف عبر مثل IFR، وإشارة الفلورسنت الخضراء التي تم جمعها على الأصفار القنوات، واثنين في قناة الكشف الصحيح، القناة الأولى وثلاثة، كنسبة من الخلفية جمع الإشارات. تحديد التوقعات المباشرة لتدفق مقبول البيانات من قبل الأطوال الموجية الإثارة المانحة بنسبة الخلفية التي تم جمعها على النقيض من قياسات المعايرة الحمراء والإثارة نافذة الوقت الفوري عن طريق الليزر الأخضر إلى حساب الصحيح الخلفية الحق في تأخير الوقت نافذة الإثارة بواسطة الليزر الأحمر. حساب السطوع الجزيئي للB كل من قوة التدفق الأخضر والأحمر على أساس الخلفية التي تم جمعها التباين، والحصول على عدد من الجزيئات والتركيز على 3 DT تناسب الانتشار.

تناسب كل من الارتباطات فائقة من القناة الخضراء والحمراء، وكذلك عبر الارتباط من المطالبة الخضراء والتأخير الأحمر من الحمض النووي على مستوى مزدوج لنموذج نشر DT 3 يحافظ على الحصول على عوامل على شكل ثابت لوظائف الارتباط التلقائي. عامل الشكل لدوال الارتباط المتبادل عادة ما يكون بين هاتين القيمتين. تحديد السعة في وقت الارتباط صفر استنادا إلى قيم الخط من العدد الظاهر من الجزيئات والتركيز.

حساب نسبة السعة لعينة كان 100٪ نشر مشترك من قوة الكلمة الخضراء والحمراء. احتواء عينات الخلية إلى نموذج مناسب. كيف كنت تظهر نشر مستقبلات الغشاء ليست غريبة بطريقة ثنائية مشروط كان قصيرا، لا وقت نشر طويلة.

بالإضافة إلى ذلك ، يجب النظر في فيزياء الصور والوميض خارج قوة الأرضية. هنا إلى TD1 و TD2 ، هما المطلوبان لنشر مرات. واحد هو جزء صغير من وقت الانتشار الأول على النقيض من قياس المعايرة التي تنتشر فيها خيوط النرد والحمض النووي الحر ، تظهر جميع الاتجاهات ومستقبلات الأغشية انتشارا ثنائي الأبعاد فقط على طول أغشية الخلايا لحساب تركيز بروتينات التسمية الخضراء أو الحمراء من احترام عدد الجزيئات والتركيز.

وحجم عنصر حجم confocal، وذلك باستخدام كتلة التحيز. تناسب الارتباطات ألتو اثنين من العينة المسماة مزدوجة باستخدام نفس النموذج كما لبناء مستوى واحد ووظيفة الارتباط عبر باستخدام نموذج نشر ثنائي مشروط، لاحظ لوصف عالمي للنظام. يجب أن تكون جميع المحاصيل الثلاثة صالحة بشكل مشترك.

مصطلح الانتشار مطابق لجميع المحاصيل الثلاثة. والفرق الوحيد هو أن وقت السمعة يقع، وظيفة الارتباط المتبادل. حساب تركيز بروتينات العمل الخضراء أو الحمراء من عدد الجزيئات المعنية والتركيز وحجم عنصر حجم الكونفوجكال.

تقدير جزء أو تركيز البروتينات الخضراء والحمراء المتفاعلة من عينات الخلية باستخدام عوامل التصحيح التي تم الحصول عليها من عينات الحمض النووي ونسب السعة لعينة الخلية والتركيزات التي تم الحصول عليها. تناسب الارتباطات تغيير اثنين من عينة فريد كعينات واحدة وصفت وارتباط الصليب الأمامي لنموذج نشر ثنائي الوسائط التي تحتوي على مصطلح الارتباط المضادة، حيث AF يعكس اتساع الارتباط المضادة الكلي وAR وTR السعة ذات الصلة ووقت الاسترخاء. في حالة التغيرات الفلورية المضادة للارتباط بسبب فريد واحد أو عدة شروط الارتباط المضادة قد تكون هناك حاجة، مما أدى إلى تراجع وظيفة فريد عبر الارتباط في أوقات الارتباط منخفضة بالتزامن مع ارتفاع في اثنين من وظائف الارتباط السيارات.

قياسات المعايرة من المحاليل الأزهار الخضراء والحمراء لعوامل الحلاقة من 6.5 والقنوات الخضراء، و 6.8 في القنوات الحمراء. وبالتالي ، فإن حجم الكونفوجكال لديه حجم 1.4 و 1.9 فيمتو في وقت لاحق من هذا اليوم القياس ، وسطوع الجزيء يكمن في 12.5 كيلوهيرتز لكل جزيء ، و 2.6 كيلوهيرتز لكل جزيء. لدينا 15٪ من الحديث المتبادل من الأزهار الخضراء إلى القنوات الحمراء بعد الإثارة المانحة و 38٪ من المباشر باستثناء الإثارة من شكل الأزهار الحمراء من قبل الأخضر، من قياس الحمض النووي لدينا، ونحن نحدد عوامل التصحيح لحجم التداخل confocal إلى 0.6 و 0.7 أيضا، والخلايا المصابة مع تسمية واحدة بناء تظهر ثنائي مشروط انتشار ثنائي الأبعاد على غشاء الخلية حيث ما يقرب من نصف الجزيئات تنتشر ببطء على مقياس الوقت 50 إلى 100 مللي ثانية والنصف الآخر سريع نسبيا حول ميلي ثانية اثنين في كلا البناءين.

بالإضافة إلى ذلك، الوميض الثلاثي موجود. ومع ذلك، في المفاجئة المستوى الأحمر بناء يتم الحصول على وقت استرخاء آخر في 180 ميكروثانية، والتي قد تنبع من المفاجئة غير منضم على التوالي. من التسمية المزدوجة نفسها ، مع تقسيم بناء المضادة المفاجئة حيث التسميات اثنين على جانبين مختلفين من غشاء الخلية ، وقد تم جمع اثنين من أقل القياسات الضوضاء ومعطف أحمر على الارتباط.

وارتباط PI المتبادل مرتفع جدا هنا. هنا 70٪ من الجزيئات، إذا كنت ببطء تحت مقياس زمني مائة مللي ثانية، وفقط 30٪ بسرعة حوالي ميلي ثانية واحدة، وجزء من جزيئات تحرير مزدوجة منخفضة وتقع بين 15 إلى 25٪، والبيانات لالتقاط CT تبدو أفضل وانها أقل ضجيجا. ومع ذلك ، لا يمكن رؤية الجبهة المتوقعة أعمق ارتباط مضاد ، وعلى الأرجح كتلة من خلال كمية عالية من الكلام المتبادل ، والإثارة قبول مباشر وامض الثلاثي من كل من قوة الأزهار ، وبمجرد أن مخططات تحليل البيانات الاستفادة من كثافة الفلورية التي تم جمعها DKS قد تساعد على انقاذ هذا كما هو مبين لمجموعة البيانات محاكاة.

ميزة تقنية فريد FCS هو أنه جنبا إلى جنب مع التنقل، يمكننا التحقيق في ديناميات المؤتمر من GPCRs. ومع ذلك ، فإن أداء FRED FCs في المختبرات يمثل تحديا ويطلب خلايا متحولة جيدة ووضع علامات فعالة وإعداد معايرة مثالية. مجرد زوج فريد الموالية القوة هو أيضا حاسمة جدا.

وتشمل الخطوات التجريبية الحاسمة التحسين الأمثل لالعاب العدوى ، والتقليل من الخلفية ، وفلورسينس السيارات. بالإضافة إلى ذلك، وسوف تساعد خط أنابيب تحليل الذرات لفهم ديناميات مختلفة من التعاليم في الخلايا الحية. نأمل أن يكون هذا البروتوكول مفيدا في تنفيذ نهج FRED FCS في تجارب الخلايا الحية.