التألق المناعي للمبيض الكامل ، والمقاصة ، والمجهر متعدد الفوتونات للتحليل الكمي 3D لاحتياطي المبيض النامي في الفأر

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أحد الأسئلة الرئيسية في المجال التناسلي ، وهو كيف ومتى تؤثر العمليات المنظمة وراثيا على حجم احتياطي المبيض الذي نعرفه يؤثر على الإناث ، طول العمر التناسلي يمكن اعتماد هذا البروتوكول للدراسات واسعة النطاق باستخدام نفس التقنيات للمبايض السليمة من مراحل النمو المختلفة. يولد بيانات قابلة للإنتاج من خلال توفير قياس كمي فعال للخلايا الجرثومية. هذه الطريقة المطبقة على الحيوانات المتنوعة وراثيا من نفس النوع يمكن أن توفر نظرة ثاقبة على العوامل الوراثية مباشرة تطور الخلايا الجرثومية والمبيض وغيرها من أعضاء التنمية.

سيوضح الإجراء ناثانيل بوشات ، وهو متدرب أبحاث من مختبري للبدء بمكان خطوة الغزير وتأمين فأر البلوغ المخدر على ظهره عن طريق تثبيت جميع الساقين بلطف من خلال منصات المخلب في وضع مريح على لوحة. لفتح التجويف الصدري للفأر ، قم بقص الأضلاع بعناية على جانبي القص أسفل الكتف مباشرة ، وتجنب ثقب الرئتين ، وأمسك الجلد أو اللوحات الضلعية بالملقط وقم بتثبيت اللوحات لفضح الأعضاء الداخلية استخدم مقص التشريح لقص الأذين الأيمن للقلب وإطلاق الدم من النظام. ثم عن طريق إمساك القلب بالملقط ، أدخل إبرة تروية في البطين الأيسر وضخ 10 ملليلتر من PBS بضغط لطيف وثابت.

عندما تتحول الأنسجة مثل الكلى الكبد والجهاز التناسلي من اللون الوردي إلى الأبيض ، استبدل PBS ب 1٪ من بارافورمالدهيد أو PFA الطازج واستمر في التروية بحوالي 10 ملليلتر من PFA. بعد ذلك ، حدد موقع وسادة الدهون مع المبيضين أسفل الكلى وتشريح الجهاز التناسلي بأكمله بلطف بما في ذلك المبيضين وسادة الدهون وقرون الرحم لوضعها في قارورة مع 4٪ PFA. ثبت المبيضين في درجة حرارة الغرفة لمدة 16 إلى 24 ساعة قبل استبدال 4٪ PFA ب 70٪ إيثانول.

في يوم تلطيخ تقليم المبيضين قبل الشروع في تلطيخ المناعة. في اليوم الأول من بروتوكول تلطيخ المناعة ماصة ملليلتر واحد من PBS لكل بئر في العدد المطلوب من الآبار في لوحة نظيفة 24 بئر. اقطع طرف ماصة 1000 ميكرولتر لعمل فتحة واسعة واستخدم الطرف العريض لنقل مبايض البلوغ بلطف من قوارير تحتوي على 70٪ إيثانول إلى الآبار ، ثم استبدل PBS في البئر ب 0.8 ملليلتر طازج من PBS في اليوم التالي استنشق PBS من الآبار لاستبداله ب 0.8 ملليلتر من المخزن المؤقت للنفاذية لكل بئر.

بعد احتضان الألواح الموجودة على الخلاط في درجة حرارة الغرفة لمدة أربع ساعات ، استبدل المخزن المؤقت للنفاذية بمخزن مؤقت مانع في اليوم الثالث ، قم بإعداد الأجسام المضادة الأولية عن طريق التخفيف في المخزن المؤقت للحظر. لتصور البويضات احتضان المبيضين قبل الولادة وقبل البلوغ مع علامات البويضات. في اليوم الثامن ، اغسل العينات بمخزن مؤقت جديد للغسيل لمدة ساعتين ثم استبدل مخزن الغسيل المؤقت ب 0.5 ملليلتر من خلطات الأجسام المضادة الثانوية المخففة في مخزن مؤقت مانع.

أغلق اللوحة باستخدام بارافيلم لمنع التبخر واحتضان العينات في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة ثلاثة أيام. في اليوم 11 بعد غسل التلطيخ المناعي ، قم بشفط المخزن المؤقت للغسيل واحتضن العينات ب 0.8 ملليلتر من محلول واحد مكعب على مقياس عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاثة أيام في الظلام. تغيير المقياس المكعب بمحلول واحد يوميا.

في اليوم 15 ، اغسل العينات ثلاث مرات لمدة 10 دقائق و 0.8 ملليلتر من PBS في درجة حرارة الغرفة مع اهتزاز لطيف. ثم استبدل PBS ب 0.8 ملليلتر من السكروز 20٪ المنزوع الغاز الطازج مع PBS متبوعا باهتزاز لطيف في درجة حرارة الغرفة. بعد ساعة واحدة ، استبدل محلول السكروز 20٪ لمعالجة العينات ب 0.8 ملليلتر من محلول مكعب المقياس لمدة أربعة إلى خمسة أيام ، كما هو موضح سابقا.

لإعداد عينة ، استخدم طرف ماصة سعة 200 ميكرولتر مع قطع الطرف لنقل مبايض البلوغ مع 15 إلى 20 ميكرولتر من محلول مكعب الحجم إلى منتصف البئر اللاصقة. بمجرد نقل المبيضين إلى البئر الفردي مع قطرة من محلول المقاصة ، ضع بلطف زجاج غطاء على البئر اللاصق واضغط لإنشاء ختم يمسح العينات ومحلول التطهير بين زلتين للغطاء. لمكان التصوير ، شطيرة انزلاق الغطاء في شريحة محول المجهر المطبوعة 3D.

قم بإعداد المعلمات للحصول على الصور وفقا لنوى الفحص المجهري أو مواصفات الشركة المصنعة. إذا كان ذلك متاحا، فاستخدم الحصول على الصور ثنائي الاتجاه لتقليل وقت المسح الضوئي وتحسين الكفاءة. اضبط متوسط الخط ومتوسط الإطار وتراكم الإطار في البرنامج.

قم بإعداد مكدس Z عن طريق تحديد موضع البداية والنهاية، ثم حدد حجم خطوة Z من ميكرومترين للمبيض قبل البلوغ وخمسة ميكرومترات للمبايض البلوغ. بعد ذلك ، قم بتنشيط ميزة تعويض Z وكسب الإثارة. اضبط تعويض Z لأسفل العينة وأعلاها عن طريق تحديد كثافة ليزر لكليهما.

استخدم وضع التجانب للعينات الأكبر التي لا يمكن التقاطها في مجال رؤية واحد. قم بتنشيط متصفح الصور والإشارة إلى عدد البلاطات اللازمة لالتقاط العينة بأكملها باستخدام أداة وضع العلامات المستطيلة. بمجرد الانتهاء من الإعداد ، ابدأ بالحصول على الصورة للصور ذات البلاطات المتعددة ، وابدأ في الحصول على الصورة باستخدام المستكشف لالتقاط جميع البلاطات.

بعد الحصول على الصورة، احفظ جميع الصور. وإذا تم الحصول على تجانبات متعددة، فقم بتشغيل أداة الفسيفساء المدمجة لدمج البلاط في صورة واحدة. لتحديد حجم البويضات، افتح الصورة وحدد خيار الشريحة لفتح صورة مكدس Zs.

حدد خيار الخط ولوحة القياس وقم بقياس المسافة عن طريق رسم خط من حافة واحدة من البويضات أو العلامة إلى الحافة الأخرى في أوسع نقطة لتحديد قطر X Y للبويضة. تحرك عبر المكدس واحصل على نطاق الأقطار لبويضات متعددة من نفس النوع. استخدم أقصر طول كمعيار لاختيار الحجم لعدد البويضات.

بعد ذلك ، في خيار عرض 3D ، حدد ميزة البقع. في لوحة المشهد ، قم بتنشيط وظيفة إضافة بقع جديدة لفتح لوحة الخوارزمية. ثم قم بإلغاء تحديد جميع إعدادات الخوارزمية كمرشح اختيار الحجم مع حجم البويضات الذي تم الحصول عليه مسبقا.

انقر على سهم القناة للأمام للانتقال إلى القناة المصدر. ثم حدد القناة ذات العلامة المفضلة واكتب القطر المكتسب في قطر X و Y المقدر. بعد تحديد الحجم ، قم بتنشيط استطالة PSF النموذجية وطرح الخلفية التي يتم تحديدها تلقائيا.

ثم، اختر السهم الأمامي الوحيد للانتقال إلى لوحة بقع التصفية وأضف مرشح الجودة لتحديد عتبة. لضمان التقدير الدقيق لأعداد البويضات تكبير الصورة. في وقت لاحق ، انقر فوق السهم المزدوج لإنهاء العد التلقائي.

استخدم علامة التبويب تحرير لتحديد البويضات الفائتة يدويا أو إلغاء تحديد جزيئات غير البويضة المحددة بواسطة العتبة التلقائية. عند الانتهاء، قم بتسجيل البيانات في علامة التبويب الإحصاءات ضمن علامة التبويب العامة لمزيد من التحليل. لتقدير إجمالي أعداد البويضات والمبيضين التالفين ، افتح صورا للمبايض السليمة باستخدام MRS وحدد ميزة الإطار.

ضمن إعدادات الإطار، حدد علامات اختيار شبكة المربع وتسميات الوصول. في الموضع علامة التبويب XYZ حدد 200 ميكروم لإنشاء علامات التجزئة مع 200 ميكرومتر من المسافات في جميع مواضع XYZ. باستخدام علامات التجزئة 200 ميكرومتر ، حدد البويضات التي تقع ضمن 50٪ من حجم كل مبيض.

انقر على ميزة البقع وحدد تسميات التحرير لتصنيف البويضات التي تقع ضمن منطقة 50٪ حسب اللون. في التدرج الرمادي التمثيلي ، يمكن رؤية صور الفوتون المتعددة للمبايض غير المندمجة وغير المنصهرة ، والبويضات الصغيرة في البصيلات البدائية مع الطبقة الرقيقة من تلطيخ DDX4 السيتوبلازمي. بالإضافة إلى ذلك ، تم رصد البويضات الأكبر داخل البصيلات المتنامية.

تمت دراسة عروض 3D من صور الفوتون المتعددة للمبايض قبل الولادة وما بعد الولادة. في اليوم 28 بعد الولادة ، احتوى المبيض من الأنثى غير المشععة على مجموعة كبيرة من البويضات الصغيرة في البصيلات البدائية. في المقابل ، كان المبيضان من الأنثى المشععة مع 0.5 رمادي من إشعاع غاما خاليا تماما من البويضات الصغيرة في البصيلات الأولية.

لكن البويضات الأكبر كانت لا تزال موجودة. من أجل تحديد كمية البويضات ، تمت معالجة صور الفوتون المتعدد 3D في برنامج MRS باستخدام مرشح goucian وتم تحديد البويضات ذات الأحجام الصغيرة والكبيرة وتحديدها كميا باستخدام ميزة البقعة. بعد ذلك ، تم حساب متوسط النسبة المئوية للبويضات في كل مرحلة مقارنة بمتوسط العدد الموجود في المرحلة المبكرة E 15.5 انخفضت أعداد البويضات بشكل حاد بين E 15.5 و E 18.5 و E 15.5 و E 18.5 البويضات الجنينية عبرت عن الخط الأول orf واحد P كما هو موضح في صور الفوتون المتعدد.

أظهر تحليل الكثافة تعبيرات أعلى للخط الأول أو واحد P لكل بويضات عند E 18.5 من E 15.5. يمكن استخدام المبيضين ذوي الأضرار الصغيرة للتحليل. يتم تحديد إجمالي أعداد البويضات باستخدام التصحيح الحسابي.

يظهر النموذج التمثيلي بويضات G CNA الإيجابية في مبيض E 15.5 مع خمس مناطق بنسبة 10٪ مميزة في مبيض سليم. وبالمثل ، تم إنشاء مبيض محاكاة مع مناطق متزايدة بنسبة 10٪ تفتقد ما يصل إلى 50٪ من المبيض. تمت مقارنة إجمالي أعداد البويضات والمبيضين المحاكيين بالمبيضين الأصليين السليمة.

وتم تقديم الفرق على أنه النسبة المئوية للانحراف يؤدي التروية الجيدة إلى جودة صورة جيدة. لذا تأكد من تنظيف جميع الأنسجة باستخدام PBS قبل التبديل إلى PFA. تأكد من أن المبيضين مكشوفان تماما عن طريق تقليم الأنسجة الإضافية.

يسمح البروتوكول بالتحليل الفعال لعدد كبير من العينات ، والبيانات الكمية التي تم الحصول عليها من المجموعات المرجعية الجينية مثل المخرجات التعاونية المتقاطعة أو المتنوعة ستساعد في تحديد المعدلات الجينية لتطوير البويضات وأعداد البويضات.