Name: Indel الكشف بعد CRISPR / Cas9 Mutagenesis باستخدام تحليل ذوبان عالية الدقة في Aedes البعوض aegypti (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-10T14:45:00.000+00:00
Duration: 5 min 30 s
Description: تعلم بروتوكول الكشف السريع عن الطفرات Indel الناتجة عن CRISPR/Cas9 في بعوضة Aedes aegypti باستخدام تحليل ذوبان عالي الدقة. هذه الطريقة الفعالة تتيح تحديد النمط الوراثي في ساعات قليلة وتسريع اختيار خطوط الطفرات للبحث الوراثي.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

تم إنشاء جميع الأرقام مع Biorender.com بموجب ترخيص لجامعة تكساس A &amp؛ M. تم دعم هذا العمل من خلال أموال من المعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية (AI137112 وAI115138 إلى Z.N.A.) ، وتكساس A & M AgriLife Research في إطار برنامج منحة الأمراض الموجهة الحشرية ، والمعهد الوطني للأغذية والزراعة في وزارة الزراعة الأمريكية ، مشروع هاتش 1018401.

1. المسح الضوئي لتعدد الأشكال النيوكليوتيدات واحد (SNPs)، تصميم التمهيدي HRMA، والتحقق من صحة التمهيدي
<ol><li>تحديد SNP في البعوض مستعمرة مختبر من النوع البري<ol><li>حدد exon الهدف لتعطيل الترجمة البوليبتيد المناسبة. ملاحظة: يجب أن يكون الهدف قريبا من كودون البداية أو بين المخلفات الرئيسية المطلوبة لوظيفة البروتين. كلما كان exon أقصر (على سبيل المثال ، ≤200 قاعدة) ، كلما كان من الصعب استهدافه وتحليله. تجنب التحرير بالقرب من حدود exon ، لأن هذا يجبر أحد التمهيديين HRMA إما على عبور intron أو أن يكون في intron. وهذا أمر غير مرغوب فيه لأن معدلات الحزب الوطني السوري تميل إلى أن تكون أكبر بكثير في تلك المناطق.</li>
		<li>تصميم التمهيدي<ol>
<li>انتقل إلى انفجار NCBI - Primer Blast website15، انسخ ولصق exon المختار في المربع الموجود أعلى الصفحة | اختيار حجم المنتج PCR (ضمان أنه يشمل معظم exon) | اختيار الكائن الحي.</li>
			<li>انقر على المعلمات المتقدمة | اختر (لPCR المنتج TM) وإضافة 60 (لدرجة حرارة مثالية من 60 درجة مئوية) | الحصول على التمهيديات. الاحتفاظ المعلمات الأخرى كإعداد افتراضي.</li>
		</ol></li>
		<li>الحصول على الحمض النووي الجينومي (gDNA) من مستعمرة مختبر البرية من النوع. خصص 10 بعوضة، وخدرها ب ثاني أكسيد الكربون، ووضعها في طبق بيتري على الجليد لإبقائها غير نشطة. إعداد 10 أنابيب تحتوي على 0.5 ميكرولتر من الكاشف لإطلاق الحمض النووي من الأنسجة و 20 ميكرولتر من العازلة التخفيف، وكلاهما المنصوص عليها في مجموعة إطلاق الحمض النووي المقترحة في جدول المواد.</li>
		<li>إزالة ساق واحدة من بعوضة واحدة باستخدام ملقط ووضعه في أنبوب المقابلة من محلول مخفف من كاشف إطلاق الحمض النووي (من الخطوة 1.1.3)، غمر تماما الساق في الحل. كرر هذه الخطوة مع البعوض المتبقي ، ومسح ملقط مع الإيثانول 70 ٪ قبل الشروع في واحد المقبل.</li>
		<li>احتضان الحل الذي يحتوي على الساق في درجة حرارة الغرفة لمدة 2-5 دقائق، ثم في 98 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة، والسماح لها لتهدئة أثناء إعداد رد فعل PCR. ملاحظة: يمكن تخزين اللوحات التي تحتوي على gDNA الصادرة عند -20 درجة مئوية، ويمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا عند هذه النقطة.</li>
		<li>إعداد 10 أنابيب تحتوي على 10 ميكرولتر من 2x PCR Master Mix، والتمهيدات لتركيز نهائي 0.5 ميكرومتر، وماء الصف الجزيئي إلى حجم نهائي قدره 20 ميكرولتر، ونقل 1 ميكرولتر من العينة المخففة إلى كل أنبوب. تنفيذ PCR التالية معلمات ركوب الدراجات هذه: 98 °C 5 دقيقة, 40 دورات من 98 °C ل 5 ق, 60 °C 30 s, 72 °C 20 s لكل كيلوبايت; التمديد النهائي ل 72 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة.</li>
		<li>تنقية منتجات PCR مع إنزيم لتتحلل التمهيديات PCR المتبقية وdNTPs dephosphorylate الزائدة أو أي عمود تنظيف عدة. تابع تسلسل العينات.</li>
		<li>تحليل كل electropherogram لوجود القمم المزدوجة / قواعد غامضة ، وضبط المكالمات الأساسية يدويا في كل تسلسل باستخدام رمز قاعدة المنحطة المناسبة. ملاحظة: يجب تنفيذ هذه الخطوة قبل محاذاة تسلسل متعددة كما هو شائع لبرنامج استدعاء قاعدة لتحديد الذروة أكثر بروزا ك استدعاء قاعدة "true" إعطاء انطباعا خاطئا غياب SNPs.</li>
		<li>قم بإجراء محاذاة تسلسل متعددة باستخدام برنامج المحاذاة، SeqMan Pro، المدرج في جدول المواد أو برامج المحاذاة مفتوحة المصدر الأخرى، مثل ClustalW16 أو T-Coffee17.<ol>
<li>فتح برنامج المحاذاة | انقر على إضافة تسلسلات | حدد التسلسلات المطلوبة وانقر على إضافة | بمجرد اختيار جميع التسلسلات، انقر على تم.</li>
			<li>انقر على تجميع لأداء المحاذاة. لفتح المحاذاة، انقر على Contig 1 وتحليل المحاذاة وتحديد SNPs (الشكل 1). ملاحظة: كبديل للخطوات 1.1.3-1.1.6، يمكن إجراء PCR من الحمض النووي الجينومي المعزول الذي تم الحصول عليه من عينات السائبة (المستمدة من >10 أفراد). يمكن تحليل التضخيمات المتسلسلة مباشرة لوجود SNPs التي تظهر كقمم مزدوجة في الفيروغرام الكهربائي ، على الرغم من أن SNPs النادرة سيكون من الصعب اكتشافها.</li>
		</ol></li>
		<li>تصميم 3-5 دليل واحد RNAs (sgRNAs)، وتجنب المناطق التي تحتوي على أي SNP المحددة أعلاه، وفقا للبروتوكول الموصوف في18.</li>
	</ol></li>
	<li>تصميم التمهيدي HRMA<ol>
<li>اختبار تسلسل exon لتشكيل المحتملة من الهياكل الثانوية أثناء PCR باستخدام mFold19.<ol>
<li>انتقل إلى خادم الويب UNAFold | انقر على | mFold في القائمة المنسدلة، انقر على التطبيقات | نموذج طي الحمض النووي.</li>
			<li>أدخل اسم التسلسل في المربع والصق exon.</li>
			<li>تغيير درجة الحرارة القابلة للطي إلى 60 درجة مئوية. على الشروط الأيونية، تغيير [مغ ++] إلى 1.5 وعلى وحدات التبديل إلى mM؛ انقر على طية DNA.</li>
			<li>على الإخراج، تحت هيكل 1، انقر على قوات الدفاع الشعبي لفتح المؤامرات هيكل دائري.</li>
		</ol>
</li>
		<li>انتقل إلى NCBI Blast - Primer Blast15 لتصميم التمهيدي.</li>
		<li>نسخ ولصق تسلسل exon المحددة بواسطة التسلسل في الخطوة 1.1 (التسلسل الذي يحتوي على أقل عدد من SNPs أو لا SNPs) في المربع الموجود أعلى الصفحة.</li>
		<li>استخدم الرمز < > لوضع علامة على التسلسلات التي تحتوي على SNPs والموقع الهدف والمناطق التي يمكن تكوينها من البنية الثانوية واستبعادها.</li>
		<li>حدد حجم منتج PCR ليكون بين 80 و 150 نقطة أساس واختر الكائن الحي. ملاحظة: يمكن استخدام أحجام الأجزاء الأكبر بنجاح (~300 bp). ومع ذلك، قد يقلل من حساسية أطول amplicons بين تسلسل تختلف في واحد أو بضعة أزواج قاعدة.</li>
		<li>انقر على الحصول على التمهيديات. حدد أزواج 2-3 من التهيئة ليتم اختبارها (من الناحية المثالية ، مواقع التمهيدي هي ≥20-50 نقطة أساس بعيدا عن أي مواقع الهدف CRISPR).</li>
	</ol></li>
	<li>التحقق من صحة التمهيدي<ol>
<li>تنفيذ PCR التدرج باستخدام gDNA من فرد واحد.<ol>
<li>قم بإعداد مزيج رئيسي وإزالة عينة واحدة لعنصر التحكم غير القالب (NTC) في أنبوب منفصل. إضافة القالب إلى المزيج الرئيسي المتبقية وaliquot في لوحة 96 جيدا.</li>
			<li>اتبع معلمات ركوب الدراجات: 98 درجة مئوية 30 s, 34 دورات من 98 °C ل 10 s, 55-65 °C 30 s, 72 °C 15 s; التمديد النهائي من 72 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.</li>
			<li>توليد ملامح ذوبان الحرارية بعد المعلمات: التشبع الخطوة 95 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة، 60 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة، تذوب منحنى الكشف بين 75 درجة مئوية و 95 درجة مئوية في 0.2 درجة مئوية الزيادات، مع وقت الانتظار من 10 ثانية في كل درجة حرارة. ملاحظة: يجب استخدام درجات الحرارة التي تملص فقط مع ملف تعريف ذوبان حراري واحد.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>المضي قدما لتوليد خطوط متحولة مع حقن الأجنة كما هو موضح في12.</li>
</ol>2. إعداد الحمض النووي الجينومي من أرجل البعوض
<ol><li>فصل البعوض G1 حسب الجنس في مرحلة الجرو بحيث لا تتزاوج قبل genotyping، وتأكد من أن البعوض مكافحة مطابقة للعمر، من النوع البري سوف تكون متاحة لاستخدامها في المراجع و backcrosses. الجنس فصل لهم بالمثل.</li>
	<li>جمع المواد اللازمة (الشكل 2A) وإعداد لوحة 96 PCR جيدا مع 0.5 ميكرولتر من كاشف إطلاق الحمض النووي و 20 ميكرولتر من العازلة تخفيف (من عدة الافراج عن gDNA) للفرد الواحد لتكون النمط الجيني (الشكل 2B) وتركها على الجليد. حجز ردين فعل للمجلس الوطني الانتقالي.</li>
	<li>تسمية صينية لقارورات البعوض (قوارير Drosophila ) بحيث يتوافق كل بئر على لوحة 96 مع قارورة البعوض المعنية في الدرج.</li>
	<li>تخدير البعوض G1 مع ثاني أكسيد الكربون ووضعها في طبق بيتري الزجاج للحفاظ عليها مخدرة (الشكل 2C، D). تخدير ووضع 8 البعوض البرية من نوع في طبق بيتري الثاني.</li>
	<li>مسح زوج من الملاقط مع الإيثانول 70٪ وإزالة واحدة من الساقين الخلفية البعوض (الشكل 2E، F).</li>
	<li>غمر الساق في محلول كاشف إطلاق الحمض النووي ، ووضع البعوض في القارورة المقابلة ، وإغلاقه بإسفنجة (الشكل 2G ، H).</li>
	<li>مسح الملاقط مرة أخرى مع الإيثانول 70٪ والمضي قدما في إزالة الساق من البعوض المقبل. كرر الخطوات 2.5-2.7 حتى يتم الانتهاء من لوحة 96 جيدا. ملاحظة: من المهم مسح الملاقط بالإيثانول بنسبة 70٪. وهذا يقلل من التلوث عبر الحمض النووي.</li>
	<li>ختم لوحة مع ختم لوحة PCR البصرية (الشكل 2I) واحتضان لوحة 96 جيدا تحتوي على الساقين في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 2-5 دقيقة ثم في 98 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة. السماح للوح لتهدئة لRT أثناء إعداد مزيج PCR. ملاحظة: تستغرق العملية بأكملها عادة 3-4 ساعة. إذا كان يجب الاحتفاظ بالبعوض في القنينات لفترة أطول من المدة المتوقعة (خاصة ≥1 يوم) ، ضع قطعة صغيرة من الزبيب (أو مصدر السكر والماء) مع كل بعوضة لضمان بقاء البعوض أثناء الحضانات الموسعة.</li>
</ol>3. HRMA
<ol><li>تنفيذ PCR.<ol>
<li>إعداد مزيج رئيسي يحتوي على المكونات التالية لكل رد فعل: 10 ميكرولتر من العازلة 2x (من مجموعة الإفراج gDNA)، 0.5 ميكرومتر من كل التمهيدي، 1 ميكرولتر من صبغة EvaGreen، 0.4 ميكرولتر من البوليميراز (من عدة إطلاق gDNA)، وكاملة إلى 19 ميكروغرام مع الماء الجزيئي الصف.</li>
		<li>باستخدام ماصة متعددة القنوات، نقل 19 ميكرولتر من المزيج الرئيسي في كل بئر. نقل 1 ميكرولتر من محلول إطلاق الحمض النووي الذي يحتوي على الحمض النووي للبعوض المعد في القسم 2 إلى اللوحة (الشكل 3A). ختم لوحة مع ختم لوحة PCR البصرية.</li>
		<li>إجراء PCR التالية المعلمات ركوب الدراجات: 98 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، 39 دورات من 98 درجة مئوية لمدة 10 ق، ودرجة حرارة العلة المختار (72 درجة مئوية) لمدة 30 s؛ التمديد النهائي 72 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة.</li>
	</ol>
</li>
	<li>توليد ملامح ذوبان الحرارية بعد المعلمات: التشبع الخطوة 95 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة، 60 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة، تذوب منحنى الكشف بين 75 درجة مئوية و 95 درجة مئوية في 0.2 درجة مئوية الزيادات، مع وقت الانتظار من 10 ثانية في كل درجة حرارة. راجع المواد التكميلية والشكل التكميلي S1-S5 للحصول على وصف مفصل لإعداد البرامج لتشغيل HRMA باستخدام نظام CFX96 في الوقت الحقيقي.</li>
	<li>فحص ملامح ذوبان (الشكل 3B). تعيين عنصر تحكم نوع wild إلى الكتلة المرجعية. ملاحظة: البرنامج (راجع جدول المواد) تلقائيا تطبيع البيانات وتعيين الكتل مع الألوان لمنحنيات melt مختلفة.</li>
	<li>وضع علامة على المجموعات المختلفة ذات الألوان المطابقة على القالب 96-well (الشكل 3C).</li>
	<li>حدد الأفراد مع منحنيات الاهتمام، وإزالتها من الأنابيب، و backcross (الشكل 3D). الدم تغذية الإناث تزاوج وجمع البيض G2 .</li>
</ol>4. التحقق من التسلسل من قبل تسلسل سانجر
<ol><li>تنقية منتج PCR من الآبار مع البعوض المحدد (من لوحة أعدت في القسم 3.1)، وذلك باستخدام إنزيم لتتحلل التمهيديات PCR المتبقية، وdNTPs الزائدة dephosphorylate. بدلا من ذلك، استخدم أي مجموعة تنظيف العمود والمضي قدما في تسلسل العينات. ملاحظة: التسلسل المباشر قد يكون أكثر تحديا عندما يكون حجم المنتج PCR صغيرة (≤200 bp). في مثل هذه الحالات، تصميم التمهيديات لتضخيم شظايا أكبر تشمل الموقع المستهدف (≥250 نقطة أساس) وتضخيم بواسطة PCR باستخدام الحمض النووي في لوحة 96 بئر (الخطوة 2.2).</li>
	<li>تحليل وتحديد indels باستخدام برنامج عارض التتبع (الشكل 4). بدلا من ذلك، بولي بيك محلل software20 يمكن أن تساعد في الكشف عن طفرة في الأفراد heterozygous.<ol>
<li>انتقل إلى موقع Poly Peak Parser على الويب، وحدد التسلسل من الأفراد المتحولين في القائمة استعراض ، وانسخ التسلسل المرجعي والصقه في المربع. ملاحظة: سوف تظهر المحاذاة بين أليل البديل والمرجع تلقائيا على الجانب الأيمن من الشاشة.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dengue+Guidelines+for+diagnosis%2C+treatment%2C+prevention+and+control%5BTitle%5D)+AND+%22WHO%22%5BJournal%5D)">Dengue Guidelines for diagnosis, treatment, prevention and control.</a> WHO. , Report No. 978 160(2009).</li>
<li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+epidemiology+update%5BTitle%5D)+AND+%22WHO%22%5BJournal%5D)">Zika epidemiology update.</a> WHO. , 1-13 (2019).</li>
<li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+prevention+and+control+of+Chikungunya+fever%5BTitle%5D)+AND+%22WHO%22%5BJournal%5D)">Guidelines for prevention and control of Chikungunya fever.</a> WHO. , (2009).</li>
<li>WHO. World malaria report 2020: 20 years of global progress and challenges. World Health Organization. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.who.int/publications/i/item/9789240015791">https://www.who.int/publications/i/item/9789240015791</a> (2020).</li>
<li>Qiu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation+detection+using+Surveyor+nuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Mutation detection using Surveyor nuclease.</a> Biotechniques. 36 (4), 702-707 (2004).</li>
<li>Babon, J. J., McKenzie, M., Cotton, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+resolvases+T4+endonuclease+VII+and+T7+endonuclease+I+in+mutation+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">The use of resolvases T4 endonuclease VII and T7 endonuclease I in mutation detection.</a> Molecular Biotechnology. 23 (1), 73-81 (2003).</li>
<li>Erali, M., Voelkerding, K. V., Wittwer, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+melting+applications+for+clinical+laboratory+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+and+Molecular+Pathology%22%5BJournal%5D)">High resolution melting applications for clinical laboratory medicine.</a> Experimental and Molecular Pathology. 85 (1), 50-58 (2008).</li>
<li>Reed, G. H., Wittwer, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitivity+and+specificity+of+single-nucleotide+polymorphism+scanning+by+high-resolution+melting+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Sensitivity and specificity of single-nucleotide polymorphism scanning by high-resolution melting analysis.</a> Clinical Chemistry. 50 (10), 1748-1754 (2004).</li>
<li>Parant, J. M., George, S. A., Pryor, R., Wittwer, C. T., Yost, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+efficient+method+of+genotyping+zebrafish+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">A rapid and efficient method of genotyping zebrafish mutants.</a> Developmental Dynamics. 238 (12), 3168-3174 (2009).</li>
<li>Tong, S. Y., Giffard, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbiological+applications+of+high-resolution+melting+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Microbiological applications of high-resolution melting analysis.</a> Journal of Clinical Microbiology. 50 (11), 3418-3421 (2012).</li>
<li>Simko, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+DNA+melting+analysis+in+plant+research%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">High-resolution DNA melting analysis in plant research.</a> Trends in Plant Science. 21 (6), 528-537 (2016).</li>
<li>Basu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+of+end-joining+repair+for+efficient+site-specific+gene+insertion+after+TALEN%2FCRISPR+mutagenesis+in+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Silencing of end-joining repair for efficient site-specific gene insertion after TALEN/CRISPR mutagenesis in Aedes aegypti.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (13), 4038-4043 (2015).</li>
<li>O'Leary, S., Adelman, Z. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+knockout+of+female-biased+genes+AeAct-4+or+myo-fem+in+Ae.+aegypti+results+in+a+flightless+phenotype+in+female%2C+but+not+male+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 knockout of female-biased genes AeAct-4 or myo-fem in Ae. aegypti results in a flightless phenotype in female, but not male mosquitoes.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 14 (12), 0008971(2020).</li>
<li>Kojin, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aedes+aegypti+SGS1+is+critical+for+Plasmodium+gallinaceum+infection+of+both+the+mosquito+midgut+and+salivary+glands%5BTitle%5D)+AND+%22Malaria+Journal%22%5BJournal%5D)">Aedes aegypti SGS1 is critical for Plasmodium gallinaceum infection of both the mosquito midgut and salivary glands.</a> Malaria Journal. 20 (1), 11(2021).</li>
<li>Ye, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer-BLAST%3A+a+tool+to+design+target-specific+primers+for+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Primer-BLAST: a tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction.</a> BMC Bioinformatics. 13, 134(2012).</li>
<li>Larkin, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clustal+W+and+Clustal+X+version+2.0%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Clustal W and Clustal X version 2.0.</a> Bioinformatics. 23 (21), 2947-2948 (2007).</li>
<li>Notredame, C., Higgins, D. G., Heringa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-Coffee%3A+A+novel+method+for+fast+and+accurate+multiple+sequence+alignment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">T-Coffee: A novel method for fast and accurate multiple sequence alignment.</a> Journal of Molecular Biology. 302 (1), 205-217 (2000).</li>
<li>Bassett, A. R., Tibbit, C., Ponting, C. P., Liu, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+targeted+mutagenesis+of+Drosophila+with+the+CRISPR%2FCas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Highly efficient targeted mutagenesis of Drosophila with the CRISPR/Cas9 system.</a> Cell Reports. 6 (6), 1178-1179 (2014).</li>
<li>Zuker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mfold+web+server+for+nucleic+acid+folding+and+hybridization+prediction%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction.</a> Nucleic Acids Research. 31 (13), 3406-3415 (2003).</li>
<li>Hill, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly+peak+parser%3A+Method+and+software+for+identification+of+unknown+indels+using+sanger+sequencing+of+polymerase+chain+reaction+products%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Poly peak parser: Method and software for identification of unknown indels using sanger sequencing of polymerase chain reaction products.</a> Developmental Dynamics. 243 (12), 1632-1636 (2014).</li>
<li>Tsujimoto, H., Anderson, M. A. E., Myles, K. M., Adelman, Z. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+candidate+iron+transporters+from+the+ZIP%2FZnT+gene+families+in+the+mosquito+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Identification of candidate iron transporters from the ZIP/ZnT gene families in the mosquito Aedes aegypti.</a> Frontiers in Physiology. 9, 380(2018).</li>
<li>Slomka, M., Sobalska-Kwapis, M., Wachulec, M., Bartosz, G., Strapagiel, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+melting+%28HRM%29+for+high-throughput+genotyping-limitations+and+caveats+in+practical+case+studies%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">High resolution melting (HRM) for high-throughput genotyping-limitations and caveats in practical case studies.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2316(2017).</li>
<li>Vouillot, L., Thelie, A., Pollet, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+T7E1+and+surveyor+mismatch+cleavage+assays+to+detect+mutations+triggered+by+engineered+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">Comparison of T7E1 and surveyor mismatch cleavage assays to detect mutations triggered by engineered nucleases.</a> G3. 5 (3), 407-415 (2015).</li>
</ol>

ولا يوجد لدى صاحبي البلاغ تضارب في المصالح يعلنانه.

تحليل ذوبان عالية الدقة يقدم حلا بسيطا وسريعا لتحديد indels التي تم إنشاؤها بواسطة تكنولوجيا CRISPR / Cas9 في البعوض ناقلات Ae. aegypti. وهو يوفر المرونة، مما يتيح جنوة البعوض تحور لمجموعة واسعة من الجينات من عضلات الطيران إلى استقلاب الحديد وأكثر13،14. يمكن إجراء HRMA في غضون ساعات قليلة من جمع العينات إلى التحليلات النهائية. يلزم وقت إضافي لتصميم التمهيدي وسيعتمد أيضا على الوقت لتلقي أي نتائج تسلسل مطلوبة (لتحديد SNPs) وتحليلات التسلسل وترتيب التمهيدي....

وباعتبار البعوض نواقل لمسببات الأمراض مثل فيروسات حمى الضنك 1 وزيكا 2 وشيكونغونيا3 ، فضلا عن طفيليات الملاريا4، فإن البعوض يمثل تهديدا كبيرا للصحة العامة للبشر. وبالنسبة لجميع هذه الأمراض، هناك تركيز كبير للتدخل في انتقال العدوى على مكافحة ناقلات البعوض. دراسة الجينات الهامة في، على سبيل المثال، التساهل مع مسببات الأمراض، واللياقة البدنية للبعوض، والناجية، والتكاثر، ومقاومة المبيدات الحشرية أمر أساسي لوضع استراتيجيات جديدة لمكافحة البعوض. ولهذه الأغراض، أصبح تحرير الجينوم في البعوض ممارسة شائعة، لا سيما مع تطوير تكنولوجيات مثل HEs و ZFNs و TALENs ومؤخرا CRISPR مع Cas9. إنشاء سلالات تحرير الجينات ينطوي عادة على الأفراد backcrossing تحمل الطفرات المطلوبة لبضعة أجيال للحد من الآثار خارج الهدف ومؤسس (عنق الزجاجة) ، تليها عبور الأفراد heterozygous لتوليد خطوط homozygous أو عبر heterozygous. في غياب علامة مهيمنة ، من الضروري الكتابة الجينية الجزيئية في هذه العملية لأنه ، في كثير من الحالات ، لا يمكن الكشف عن سمات واضحة فينوتيبيك للمسوخ heterozygous.
على الرغم من أن التسلسل هو المعيار الذهبي لتوصيف الجينية ، فإن تنفيذ ذلك عبر المئات ، أو ربما الآلاف من الأفراد ، يفرض تكاليف كبيرة ، والعمالة ، والوقت اللازم للحصول على النتائج ، وهو أمر بالغ الأهمية للكائنات الحية ذات العمر القصير مثل البعوض. البدائل شائعة الاستخدام هي المساح النيوكليز assay5 (SNA)، T7E1 المقايسة6، وتحليل ذوبان عالية الدقة (HRMA، استعرضت in7). كل من SNA و T7E1 استخدام endonucleases التي تلتصق قواعد غير متطابقة فقط. عندما يتم تضخيم منطقة متحولة من الجينوم المتحول heterozygous ، يتم تضخيم شظايا الحمض النووي من الأليل المتحولة والبرية لجعل الحمض النووي المزدوج الذين تقطعت بهم السبل غير متطابقة (dsDNA). SNA يكشف عن وجود عدم التطابق عن طريق الهضم مع الإندونوكلياز عدم التطابق محددة وبسيطة agarose هلام الكهربائي. بدلا من ذلك، يستخدم HRMA الخصائص الديناميكية الحرارية ل dsDNA التي تم اكتشافها بواسطة الأصباغ الفلورية الملزمة dsDNA، مع اختلاف درجة حرارة فصل الصبغة استنادا إلى وجود ونوع الطفرة. وقد استخدمت HRMA للكشف عن تعدد الأشكال أحادية النيوكليوتيدات (SNPs)8، وال جينوتيب متحولة من حمار وحشي fish9، التطبيقات الميكروبيولوجية10، والبحوث الوراثية النباتية11، من بين أمور أخرى.
تصف هذه الورقة HRMA ، وهي طريقة بسيطة للجنوة الجزيئية للبعوض المتحول الناتج عن تقنية CRISPR /Cas9. مزايا HRMA على التقنيات البديلة تشمل 1) المرونة، كما ثبت أنها مفيدة لمختلف الجينات، ومجموعة واسعة من أحجام indel، فضلا عن التمييز بين أحجام indel مختلفة و heterozygous، homozygous، وعبر heterozygous differentiation12،13،14، 2) التكلفة، كما أنها تقوم على الكواشف PCR المستخدمة عادة، و 3) توفير الوقت، كما يمكن أن يؤديها في غضون ساعات قليلة. بالإضافة إلى ذلك ، يستخدم البروتوكول جزءا صغيرا من الجسم (ساقا) كمصدر للحمض النووي ، مما يسمح للبعوض بالبقاء على قيد الحياة في عملية الكتابة الجينية ، مما يسمح بإنشاء وصيانة خطوط متحولة.

<table><tbody><tr><td>70٪ إيثانول</td><td></td><td></td><td>70٪ محلول إيثانول في الماء</td></tr><tr><td>96 بئر PCR وألواح PCR في الوقت الحقيقي</td><td>VWR</td><td>82006-636</td><td>للحصول على الحمض النووي الجيني (من ساق البعوض)قوالب</td></tr> <tr><td></td><td></td><td>لوحة 96 بئر</td><td>مطبوعة منزليا ، لتسجيل النمط الجيني</td></tr> آلة <tr><td>BioRad CFX96</td><td>Bio Rad</td><td></td><td>PCR مع قدرات</td></tr> <tr><td>التدرج و HRMAخزانات كاشف التكنولوجيا الحيوية المتنوعة</td><td>VWR</td><td>490006-896</td><td></td></tr> مجموعة تنظيف <tr><td>Exo-CIP Rapid PCR</td> New <td>England Biolabs</td><td>E1050S</td><td></td></tr><tr><td>Glass Petri Dish</td><td>VWR</td><td>89001-246</td><td>150 مم × 20 مم</td></tr><tr><td>ألواح PCR ذات الغلاف الصلب ذات الجدار الرقيق 96 بئر لوحات PCR</td><td>Bio-rad</td><td>HSP9665</td><td>للماصات متعددة القنوات HRMA</td></tr><tr><td>(P10)</td> <td>Integra Biosciences</td><td>4721</td><td></td></tr><tr><td>ماصة متعددة القنوات (P300)</td><td>Integra Biosciences</td><td>4723</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Polyolefin Acrylate Sealing Tape ، Thermo Scientific</td><td>VWR</td><td>37000-548</td><td>للاستخدام مع 96-well&nbsp ؛ لوحات PCR للحصول على الحمض النووي</td></tr><tr><td>الجيني شريط الختم البصري</td><td>Bio-rad</td><td>2239444</td><td>للاستخدام مع لوحات PCR ذات 96 بئر لمجموعة</td></tr><tr><td>PCR المباشرة للأنسجة الحيوانية HRMA Phire (بدون أدوات أخذ العينات)</td> <td>Thermo Fisher</td><td>F140WH</td><td>للحصول على الحمض النووي الجيني وإجراء</td></tr><tr><td>فواصل قارورة الذبابة البلاستيكية</td><td>PCR Genesee</td><td>59-128W</td><td></td></tr><tr><td>برنامج تحليل الذوبان الدقيق</td><td>Bio Rad</td><td>1845025</td><td>يستخدم للتنميط الجيني لعينات الحمض النووي للبعوض وتحليل خصائص التمسخ الحراري للحمض النووي المزدوج الشريطة (انظر خطوة البروتوكول 3.3)</td></tr> <tr>برنامج <td></td><td>SeqMan Pro</td><td>DNAstar Lasergene</td><td>لمحاذاة التسلسل المتعدد</td></tr><tr><td>الماصة أحادية القناة</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tweezers Dumont # 5 11 cm</td><td>WPI</td><td>14098</td><td></td></tr><tr><td>سدادات الرغوة البيضاء</td><td>VWR</td><td>60882-189</td><td></td></tr><tr><td>قارورة ذبابة الفاكهة العريضة ، علبة قارورة</td><td></td> ذبابة عريضة من البوليسترين <td>جينيسي 32-117</td><td></td></tr><tr><td>، زرقاء</td><td>جينيسي</td><td>59-164B</td><td></td></tr></tbody></table>

indel الكشف بعد crispr / cas9 mutagenesis باستخدام تحليل ذوبان عالية الدقة في aedes البعوض aegypti

Indel Detection following CRISPR/Cas9 Mutagenesis using High-resolution Melt Analysis in the Mosquito Aedes aegypti

أصبح تحرير الجينات البعوض روتينية في العديد من المختبرات مع إنشاء نظم مثل النسخ المنشط مثل النوى تأثير (TALENs)، نواة الزنك إصبع (ZFNs)، وتوجيه الإندونوكلياس (HEs). وفي الآونة الأخيرة، قدمت تكنولوجيا البروتين 9 (Cas9) المترابطة بانتظام القصيرة المترابطة (CRISPR)/CRISPR المرتبطة بالبروتين 9 (Cas9) بديلا أسهل وأرخص لهندسة الجينوم الدقيقة. بعد عمل النيوكليز، سوف إصلاح مسارات إصلاح الحمض النووي إصلاح نهايات الحمض النووي مكسورة، وإدخال indels في كثير من الأحيان. ثم تستخدم هذه الطفرات خارج الإطار لفهم وظيفة الجينات في الكائنات الحية المستهدفة. ومع ذلك، فإن العيب هو أن الأفراد المتحولين لا يحملون علامة مهيمنة، مما يجعل تحديد وتتبع الأليل المتحولة أمرا صعبا، خاصة على المقاييس اللازمة للعديد من التجارب. 
تحليل ذوبان عالية الدقة (HRMA) هو وسيلة بسيطة لتحديد الاختلافات في تسلسل الحمض النووي ويستخدم منحنيات ذوبان PCR للكشف عن مثل هذه الاختلافات. تستخدم طريقة تحليل ما بعد PCR هذه الأصباغ الفلورية المزدوجة الملزمة للحمض النووي مع أجهزة لديها قدرة على التقاط البيانات التحكم في درجة الحرارة ويتم تحجيمها بسهولة إلى تنسيقات 96 لوحة جيدة. وصف هنا هو سير عمل بسيط باستخدام HRMA للكشف السريع عن كريسبر / Cas9 الناجمة عن indels وإنشاء خطوط متحولة في Ae. aegypti البعوض. بشكل حاسم ، يمكن تنفيذ جميع الخطوات مع كمية صغيرة من أنسجة الساق ولا تتطلب التضحية بالكائن الحي ، مما يسمح بإجراء الصلبان الوراثية أو المقايسات الفينوتيبينج بعد الكتابة الجينية.

تم الحصول على البعوض الذي يحتوي على طفرات في الجينات AaeZIP11 (الناقل المفترض الحديد21) وميو فيم (جين الميوسين المتحيزة للإناث المتعلقة عضلات الطيران13) باستخدام تكنولوجيا CRISPR/Cas9، النمط الجيني باستخدام HRMA، والتحقق من التسلسل (الشكل 5). الشكل 5A والشكل 5C تظهر كثافة الفلورية تطبيع من منحنيات إدارة الموارد البشرية من AaeZIP11 وعينات متحولة ميو-fem</e...

هذه المادة تفاصيل بروتوكول لتحديد سريع من indels الناجمة عن CRISPR / Cas9 واختيار خطوط متحولة في Aedes aegypti البعوض باستخدام تحليل ذوبان عالية الدقة.

Indel الكشف بعد CRISPR / Cas9 Mutagenesis باستخدام تحليل ذوبان عالية الدقة في Aedes البعوض aegypti

Mosquito gene editing has become routine in several laboratories with the establishment of systems such as transcription-activator-like effector nucleases ...

هذا البروتوكول هو وسيلة بسيطة جدا وفعالة للكشف عن المسوخ التي ولدتها التكنولوجيا CRISPR / Cas9 من العديد من الأفراد. والميزتان الرئيسيتان لهذه التقنية هما أنه يمكن القيام بذلك في غضون ساعات قليلة وأنه ينطبق على العديد من الكائنات الحية. تصميم التمهيدي يمكن أن يكون تحديا لبعض الجينات وجولات متعددة من تصميم التمهيدي والتحقق قد تكون هناك حاجة لجعل HRMA كفاءة.لتنفيذ PCR متدرجة، ابدأ بإعداد مزيج رئيسي. ثم قم بإزالة 19 ميكرولتر من المزيج الرئيسي للتحكم غير القالب أو NTC في لوحة 96 جيدا. ثم قم بإضافة القالب إلى المزيج الرئيسي المتبقي.Aliquot 20 ميكرولتر من مزيج العينة في لوحة 96 جيدا. نفذ PCR باتباع معلمات ركوب الدراجات ثم قم بتوليد ملفات تعريف الذوبان الحراري باستخدام المعلمات المذكورة في المخطوطة. بعد جمع جميع المواد المطلوبة، وإعداد مزيج رئيسي مع 0.5 ميكرولتر من كاشف إطلاق الحمض النووي و 20 ميكرولتر من العازلة تخفيف لكل فرد لتكون النمط الجيني.باستخدام ماصة متعددة القنوات، aliquot 20 ميكرولتر من هذا المزيج في لوحة PCR وترك لوحة PCR على الجليد. بعد ذلك ، ضع بعوض G1 المخدر في طبق بيتري زجاجي لإبقائه مخدرا ووضع ثمانية بعوض من النوع البري في طبق بيتري الثاني. مسح زوج من الملاقط مع 70٪ الإيثانول واستخدام ملاقط تطهيرها لإزالة واحدة من البعوض الساقين الخلفيتين.ثم غمر الساق في محلول كاشف إطلاق الحمض النووي. ضع البعوضة في القارورة المقابلة واغلق القارورة بإسفنجة. بمجرد الانتهاء ، امسح الملاقط بإيثانول بنسبة 70٪ قبل الشروع في إزالة الساق من البعوضة التالية حتى يتم الانتهاء من لوحة 96 بئرا.في وقت لاحق، ختم لوحة مع ختم لوحة PCR البصرية واحتضان لوحة PCR التي تحتوي على الساقين في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين إلى خمس دقائق، تليها الحضانة في 98 درجة مئوية لمدة دقيقتين. السماح للطبق لتبرد إلى درجة حرارة الغرفة. لPCR، وإعداد مزيج رئيسي يحتوي على المكونات المفضلة ومن ثم استخدام ماصة متعددة القنوات لنقل 19 ميكرولتر من المزيج الرئيسي في كل بئر من لوحة 96 جيدا.بعد نقل ميكرولتر واحد من محلول إطلاق الحمض النووي الذي يحتوي على الحمض النووي للبعوض الذي تم إعداده مسبقا إلى اللوحة ، ختم اللوحة بختم لوحة PCR بصري. قم بإجراء PCR باستخدام معلمات ركوب الدراجات المناسبة لإنشاء ملفات تعريف ذوبان حراري باتباع المعلمات الموضحة في المخطوطة ، ثم قم بفحص ملفات تعريف الذوبان عن طريق تعيين التحكم البري إلى الكتلة المرجعية. وضع علامة على المجموعات المختلفة ذات الألوان المطابقة على قالب 96-well.بعد ذلك، حدد الأفراد مع منحنيات الاهتمام وإزالة الأفراد المحددين من أنابيب إلى الصليب مرة أخرى. الدم تغذية جعلت من الإناث، تليها جمع G2As. في التحليل التمثيلي، يظهر تحليل تسلسل متحولة ZIP11 من Aedes aegypti.يشير التصوير الكهربائي من مسوخ Aedes aegypti ZIP11 heterozygous إلى موضع النيوكليوتيدات حيث حدث ال indel. ويمثل indel من خلال التحول من قمم واحدة إلى مزدوجة كما تظهر المواقف متعددة الأشكال على حد سواء النيوكليوتيدات بما يصاحب ذلك. في نهاية التشغيل، تم حساب عدد الأزواج الأساسية المحذوفة أو المدرجة عن طريق حساب القمم المفردة.البعوض الذي يحتوي على طفرات في الجينات Aedes aegypti ZIP11 وميو-fem تم كتابتها جينيا وتم التحقق منها تسلسلا باستخدام تحليل ذوبان عالي الدقة ل HRMA. وتم تطبيع الإشارات الفلورية للعينات إلى قيم نسبية تؤهن من واحد إلى صفر. بالإضافة إلى ذلك، تم طرح كل منحنى من مرجع النوع البرية ويدل على التكبير المقابل.وتظهر عملية تعيين مجموعة تلقائية فاشلة في النتائج التمثيلية، حيث لم يتم التمييز بشكل سليم بين المجموعات. علاوة على ذلك، تم تحليل كل عينة بشكل فردي وتعيينها إلى المجموعات الصحيحة استنادا إلى التشابه مع العينات المرجعية من الهيتروزجوت، والهوزيغوت، وtransheterozygotes. بعد إجراء HRMAs ، تسلسل الحمض النووي من الأفراد المتحولين ضروري لتحليل indels وتحديد الطفرات الأخرى في التسلسل المستهدف.

indel-detection-following-crisprcas9-mutagenesis-using-high

Research

JoVE Journal

Genetics

علم الوراثة

يوضح هذا الفيديو دور تفاعل البوليميراز المتسلسل للقطرات الرقمية في تحديد طفرة indel في عينة الحمض النووي. تتيح الدقة العالية والحساسية ل ddPCR الكشف الدقيق والمتسق عن الطفرات النادرة الموجودة في العينة ، حتى عند المستويات المنخفضة. يمكنه تحديد وتحديد طفرات indel في مناطق مختلفة من الجينوم ، مما يوفر رؤى قيمة حول آليات الطفرة والعواقب الوظيفية لهذه الطفرات.

تفاعل بوليميراز القطرات الرقمية للكشف عن طفرات Indel في الجينات المستهدفة

يوضح هذا الفيديو تفاعل البوليميراز المتسلسل المتدرج لتحسين درجة حرارة التلدين للبادئات ، والتي تحدد درجة حرارة التلدين المتدرج على طول الآبار. يتم تحديد تأثير درجات حرارة التلدين المختلفة من خلال إنتاجية المنتجات المضخمة التي تساعد على تحسين حالة التفاعل.

تفاعل البوليميراز المتسلسل المتدرج لتحديد درجة حرارة التلدين المثلى

ويحدد هذا البروتوكول سير العمل للجين كريسبر/Cas9-على أساس تحرير النظام للإصلاح من الطفرات في خلايا الثدييات. هنا، علينا استخدام نهج اندماجي لتحرير الجينات مع استراتيجية تجريبية متابعة مفصلة لقياس تشكيل إينديل في الموقع المستهدف، في جوهرها، تحليل الطفرات في الموقع.

منهجية موحدة لدراسة المحدثة للطفرات في الموقع كدالة لإصلاح نقطة تحور تحفزها كريسبر/Cas9 وسودن في الخلايا البشرية

يصف هذا البروتوكول إجراءات التلقيح المجهري لأجنة Culex quinquefasciatus التي تم تحسينها للعمل مع أدوات تحرير الجينات CRISPR/Cas9. يمكن لهذه التقنية أن تولد بكفاءة طفرات جرثومية محددة الموقع وقابلة للوراثة يمكن استخدامها لبناء تقنيات جينية في ناقلات الأمراض هذه غير الم مدروسة.

تقنيات التلقيح الدقيق الجنيني لتولد موتاسيس محدد الموقع الفعال في Culex quinquefasciatus

يستخدم CRISPR/Cas9 بشكل متزايد لتوصيف وظيفة الجينات في الكائنات غير النموذجية. يصف هذا البروتوكول كيفية توليد خطوط خروج المغلوب من Culex pipiens، من إعداد خلطات الحقن ، إلى الحصول على أجنة البعوض وحقنها ، وكذلك كيفية تربية البعوض المحقون وعبوره وفحصه وذريه للطفرات المطلوبة.

إعداد وحقن أجنة البعوض Culex لتوليد الطفرات فارغة باستخدام CRISPR / Cas9

يظهر هنا بروتوكول الحقن المجهري للأجنة Helicoverpa armigera (Hübner) وتحديد الطفرات بالضربة القاضية التي تم إنشاؤها بواسطة تحرير الجينوم CRISPR / Cas9. تتيح الحشرات الطافرة إجراء مزيد من الأبحاث حول وظيفة الجينات والتفاعل بين الجينات المختلفة في الجسم الحي.

الحقن المجهري للأجنة وتحديد المتحورات بالضربة القاضية ل CRISPR / Cas9 Genome edited Helicoverpa Armigera (Hübner)

يصف البروتوكول كيفية تحقيق تعديلات موجهة للموقع في جينوم بعوض ملاريا الأنوفيليس باستخدام نظام φC31 . وتشمل التعديلات الموصوفة كلا من تكامل وتبادل الأشرطة المعدلة وراثيا في جينوم خطوط الالتحام الحاملة ل attP.

التكامل بوساطة φC31 الموجهة بالموقع وتبادل الكاسيت في نواقل الأنوفيليس للملاريا

يوفر هذا البروتوكول الخطوات من استخراج الحمض النووي إلى الإعداد التجريبي ل PCR القطيرات الرقمية (ddPCR) ، بما في ذلك تحليل لتحديد وتحديد كمي لأحداث الانضمام النهائي غير المتجانسة (NHEJ) في المواقع المستهدفة بعد انشقاق Cas9 الناجم عن الحمض النووي الريبي وإصلاح الحمض النووي. وتشمل الاستخدامات الأخرى لهذه الطريقة تطبيقات مثل الكشف عن تعدد الأشكال والتحقق من متغير تحرير الجينات.

ثنائي الفينيل متعدد الكلور الرقمي القطيرات للكشف عن طفرات Indels في مجموعات البعوض Anopheline المعدلة وراثيا

هنا ، نصف بروتوكولا مفصلا لتحرير الجينوم من خلال الحقن المجهري الجنيني في البعوض A. aegypti باستخدام تقنية CRISPR-Cas9.

تحرير الجينوم في بعوض الحمى الصفراء الزاعجة المصرية باستخدام CRISPR-Cas9

المشفرة وراثيا هيستون-miniSOG يدفع الطفرات الوراثية الجينوم على نطاق بطريقة تعتمد الخفيفة والأزرق. هذه الطريقة الطفرات بسيطة وسريعة وخالية من المواد الكيميائية السامة، ومناسبة تماما للفحص الجيني إلى الأمام والتكامل التحوير.

علم البصريات الوراثي الطفرات عشوائية عن طريق هيستون-miniSOG في<em&gt; C. ايليجانس</em

تعلم بروتوكول الكشف السريع عن الطفرات Indel الناتجة عن CRISPR/Cas9 في بعوضة Aedes aegypti باستخدام تحليل ذوبان عالي الدقة. هذه الطريقة الفعالة تتيح تحديد النمط الوراثي في ساعات قليلة وتسريع اختيار خطوط الطفرات للبحث الوراثي.

Indel الكشف بعد CRISPR / Cas9 Mutagenesis باستخدام تحليل ذوبان عالية الدقة في Aedes البعوض aegypti

استكشف المزيد من الفيديوهات