Indel الكشف بعد CRISPR / Cas9 Mutagenesis باستخدام تحليل ذوبان عالية الدقة في Aedes البعوض aegypti
سبتمبر 10, 2021
هذه المادة تفاصيل بروتوكول لتحديد سريع من indels الناجمة عن CRISPR / Cas9 واختيار خطوط متحولة في Aedes aegypti البعوض باستخدام تحليل ذوبان عالية الدقة.
هذا البروتوكول هو وسيلة بسيطة جدا وفعالة للكشف عن المسوخ التي ولدتها التكنولوجيا CRISPR / Cas9 من العديد من الأفراد. والميزتان الرئيسيتان لهذه التقنية هما أنه يمكن القيام بذلك في غضون ساعات قليلة وأنه ينطبق على العديد من الكائنات الحية. تصميم التمهيدي يمكن أن يكون تحديا لبعض الجينات وجولات متعددة من تصميم التمهيدي والتحقق قد تكون هناك حاجة لجعل HRMA كفاءة.
لتنفيذ PCR متدرجة، ابدأ بإعداد مزيج رئيسي. ثم قم بإزالة 19 ميكرولتر من المزيج الرئيسي للتحكم غير القالب أو NTC في لوحة 96 جيدا. ثم قم بإضافة القالب إلى المزيج الرئيسي المتبقي.
Aliquot 20 ميكرولتر من مزيج العينة في لوحة 96 جيدا. نفذ PCR باتباع معلمات ركوب الدراجات ثم قم بتوليد ملفات تعريف الذوبان الحراري باستخدام المعلمات المذكورة في المخطوطة. بعد جمع جميع المواد المطلوبة، وإعداد مزيج رئيسي مع 0.5 ميكرولتر من كاشف إطلاق الحمض النووي و 20 ميكرولتر من العازلة تخفيف لكل فرد لتكون النمط الجيني.
باستخدام ماصة متعددة القنوات، aliquot 20 ميكرولتر من هذا المزيج في لوحة PCR وترك لوحة PCR على الجليد. بعد ذلك ، ضع بعوض G1 المخدر في طبق بيتري زجاجي لإبقائه مخدرا ووضع ثمانية بعوض من النوع البري في طبق بيتري الثاني. مسح زوج من الملاقط مع 70٪ الإيثانول واستخدام ملاقط تطهيرها لإزالة واحدة من البعوض الساقين الخلفيتين.
ثم غمر الساق في محلول كاشف إطلاق الحمض النووي. ضع البعوضة في القارورة المقابلة واغلق القارورة بإسفنجة. بمجرد الانتهاء ، امسح الملاقط بإيثانول بنسبة 70٪ قبل الشروع في إزالة الساق من البعوضة التالية حتى يتم الانتهاء من لوحة 96 بئرا.
في وقت لاحق، ختم لوحة مع ختم لوحة PCR البصرية واحتضان لوحة PCR التي تحتوي على الساقين في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين إلى خمس دقائق، تليها الحضانة في 98 درجة مئوية لمدة دقيقتين. السماح للطبق لتبرد إلى درجة حرارة الغرفة. لPCR، وإعداد مزيج رئيسي يحتوي على المكونات المفضلة ومن ثم استخدام ماصة متعددة القنوات لنقل 19 ميكرولتر من المزيج الرئيسي في كل بئر من لوحة 96 جيدا.
بعد نقل ميكرولتر واحد من محلول إطلاق الحمض النووي الذي يحتوي على الحمض النووي للبعوض الذي تم إعداده مسبقا إلى اللوحة ، ختم اللوحة بختم لوحة PCR بصري. قم بإجراء PCR باستخدام معلمات ركوب الدراجات المناسبة لإنشاء ملفات تعريف ذوبان حراري باتباع المعلمات الموضحة في المخطوطة ، ثم قم بفحص ملفات تعريف الذوبان عن طريق تعيين التحكم البري إلى الكتلة المرجعية. وضع علامة على المجموعات المختلفة ذات الألوان المطابقة على قالب 96-well.
بعد ذلك، حدد الأفراد مع منحنيات الاهتمام وإزالة الأفراد المحددين من أنابيب إلى الصليب مرة أخرى. الدم تغذية جعلت من الإناث، تليها جمع G2As. في التحليل التمثيلي، يظهر تحليل تسلسل متحولة ZIP11 من Aedes aegypti.
يشير التصوير الكهربائي من مسوخ Aedes aegypti ZIP11 heterozygous إلى موضع النيوكليوتيدات حيث حدث ال indel. ويمثل indel من خلال التحول من قمم واحدة إلى مزدوجة كما تظهر المواقف متعددة الأشكال على حد سواء النيوكليوتيدات بما يصاحب ذلك. في نهاية التشغيل، تم حساب عدد الأزواج الأساسية المحذوفة أو المدرجة عن طريق حساب القمم المفردة.
البعوض الذي يحتوي على طفرات في الجينات Aedes aegypti ZIP11 وميو-fem تم كتابتها جينيا وتم التحقق منها تسلسلا باستخدام تحليل ذوبان عالي الدقة ل HRMA. وتم تطبيع الإشارات الفلورية للعينات إلى قيم نسبية تؤهن من واحد إلى صفر. بالإضافة إلى ذلك، تم طرح كل منحنى من مرجع النوع البرية ويدل على التكبير المقابل.
وتظهر عملية تعيين مجموعة تلقائية فاشلة في النتائج التمثيلية، حيث لم يتم التمييز بشكل سليم بين المجموعات. علاوة على ذلك، تم تحليل كل عينة بشكل فردي وتعيينها إلى المجموعات الصحيحة استنادا إلى التشابه مع العينات المرجعية من الهيتروزجوت، والهوزيغوت، وtransheterozygotes. بعد إجراء HRMAs ، تسلسل الحمض النووي من الأفراد المتحولين ضروري لتحليل indels وتحديد الطفرات الأخرى في التسلسل المستهدف.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
يفصل هذا المقال بروتوكولاً للتحديد السريع للطفرات من نوع الحذف والإدراج (indels) المستحثة بواسطة تقنية CRISPR/Cas9 واختيار السلالات الطافرة في بعوضة Aedes aegypti باستخدام تحليل الصهر عالي الدقة. وتتميز هذه الطريقة بالكفاءة والقابلية للتطبيق على كائنات متنوعة، مما يتيح الكشف السريع عن الطفرات.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- علم الوراثة
- البيولوجيا الجزيئية
- علم الحشرات
خلفية علمية
- تُستخدم تقنية CRISPR/Cas9 على نطاق واسع في التحرير الجيني.
- يعد تحديد الطفرات بكفاءة أمراً بالغ الأهمية في الدراسات الوراثية.
- يوفر تحليل الانصهار عالي الدقة (HRMA) طريقة كشف سريعة.
- يمكن أن تؤثر التحديات في تصميم البادئات على كفاءة تحليل HRMA.
الغرض من الدراسة
- توفير بروتوكول لتحديد الطفرات المستحدثة بواسطة CRISPR.
- إثبات إمكانية تطبيق تحليل تباين انصهار الحمض النووي عالي الدقة (HRMA) في كائنات حية مختلفة.
- تبسيط عملية اختيار السلالات الطافرة.
الطرق المستخدمة
- تحضير المزيج الرئيسي (master mix) لتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).
- استخدام ضوابط عدم وجود قالب (NTC) في لوحة ذات 96 بئراً.
- استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل المتدرج (Gradient PCR) لتحسين الظروف.
- تحليل الصهر عالي الدقة (High-resolution melt analysis) للكشف عن عمليات الإدخال والحذف (indels).
النتائج الرئيسية
- يتيح البروتوكول التعرف السريع على الطفرات.
- يمكن إتمام تحليل HRMA في غضون ساعات قليلة.
- قد تكون هناك حاجة لجولات متعددة من تصميم البادئات لضمان الكفاءة.
- تتميز هذه الطريقة بتعدد استخداماتها عبر الأنواع المختلفة.
الاستنتاجات
- يعزز هذا البروتوكول من كفاءة الكشف عن الطفرات.
- يوفر هذا البروتوكول أداة قيمة للأبحاث الجينية في البعوض.
- يمكن للدراسات المستقبلية الاعتماد على هذه الطريقة من أجل تطبيقات أوسع نطاقاً.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
يتيح الكشف السريع عن عمليات الإدراج والحذف (indels) الناتجة عن CRISPR/Cas9 التحقق الفعال من الأهداف في أبحاث مكافحة النواقل، مما يقلل الجداول الزمنية للدراسات الوظيفية للجينات. ويدعم تحليل الانصهار عالي الدقة (High-resolution melt analysis) تحديد الأنماط الجينية القابلة للتوسع دون الحاجة إلى التضحية بالكائن الحي، مما يسهل المقايسات المظهرية والتهجينات الجينية اللاحقة. ويعزز هذا النهج الثقة التنبؤية في مراحل الاكتشاف المبكرة من خلال توفير كشف كمي عن الطفرات من عينات أنسجة ضئيلة.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: تتيح استقصاء الفرضيات العلاجية من خلال الكشف السريع عن الطفرات من نوع Indel عقب عملية التطفير باستخدام تقنية CRISPR.
- القيمة التشغيلية: تدعم تقليل المخاطر البيولوجية عن طريق تحديد الأليلات الطافرة دون التضحية بالكائنات الحية، مما يحافظ على العينات لإجراء فحوصات لاحقة.
- التأثير على مجموعة المشاريع: تسرع تدفقات عمل التحقق من الأهداف، مما يسمح بتحديد أولويات الأهداف الجينية بشكل أسرع في الأنظمة ذات الصلة بالأمراض.
الفحص وتطوير المقايسة
- القيمة العلمية: ينتج منحنيات انصهار فلورية مُعايرة تتيح المقارنة الكمية بين الأنماط الجينية البرية والطفرات.
- القيمة التشغيلية: متوافق مع تنسيقات الأطباق ذات 96 بئراً، مما يدعم الفحص متوسط الإنتاجية للأفراد المعدلين.
- جاهزية المقايسة: يولد ملفات انصهار مميزة للمتغايرات الزيجوت، والمتماثلات الزيجوت، والمتغايرات الزيجوتية العابرة، مما يتيح تعيين المجموعات بشكل موثوق.
الأبحاث الترجمية وما قبل السريرية
- الاستمرارية الانتقالية: تتيح إجراء التنميط الجيني متبوعاً بالتنميط الظاهري أو التغذية الدموية، مما يربط التعديل الجيني بالنتائج الوظيفية في نماذج الأمراض.
- تقليل المخاطر الميكانيكية: تسهل توصيف عمليات الإدخال والحذف (indel) عبر التسلسل اللاحق، مما يؤكد التأثيرات المستهدفة ويحدد التعديلات المحتملة خارج الهدف.
- دعم النماذج قبل السريرية: تمكن من إنشاء سلالات طافرة في Aedes aegypti، وهو ناقل رئيسي لدراسات انتقال الفيروسات المنقولة بالمفصليات.
تكامل مسار العمل ومنظومة التشغيل
تندرج هذه الطريقة ضمن تسلسل عملية الاكتشاف بدءاً من الطفرات الموجهة بواسطة CRISPR وصولاً إلى تحديد المركبات الرائدة، مما يوفر نقطة تفتيش للتنميط الجيني قبل مرحلة التحقق الوظيفي.
- بيولوجيا الاكتشاف: تدعم اختبار الفرضيات من خلال التحديد السريع للطفرات من نوع (indels) التي تعطل وظيفة الجين في المسارات المستهدفة.
- الفحص: تتيح توحيد معايير المقايسة من خلال تحليل منحنى الانصهار المعياري والتجميع القائم على المراجع.
- التحليلات: تُنتج إزاحات كمية في ملف الانصهار ترتبط بحجم (indel)، مما يتيح إجراء تحليل مقارن عبر العينات.
- الأبحاث الانتقالية: تربط التعديل الجيني بالتقييم المظهري من خلال السماح باستخدام الكائنات الحية بعد عملية التنميط الجيني.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: قابلة لإعادة الاستخدام عبر مختلف الكائنات والجينات، مع مرونة في تصميم البادئات تدعم إمكانية التطبيق على نطاق واسع من الأهداف.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تزيد من الثقة التنبؤية في التحقق من صحة الهدف من خلال تقديم أدلة مباشرة على نتائج تحرير الجينات.
- القيمة التشغيلية: تعزز إمكانية تكرار النتائج من خلال بروتوكولات PCR وتحليل الانصهار الموحدة مع ضوابط مدمجة.
- القيمة الاستراتيجية: تحسن كفاءة رأس المال عن طريق تقليل الوقت والموارد اللازمة لفحص الطفرات.
- التأثير على المحفظة: تتيح التقدم المعدل حسب المخاطر من خلال تأكيد وجود الطفرة قبل الاستثمار في فحوصات النمط الظاهري.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في تصميم وبحث البادئات وتحسينها، حيث قد تحتاج بعض الجينات إلى تكرار عمليات التصميم لضمان كفاءة تحليل صهر عالي الدقة (HRMA).
- يعتمد على أجهزة توفر تحكماً دقيقاً في تدرج درجة الحرارة وكشفاً فلورياً لإجراء تحليل الصهر عالي الدقة.
- يستلزم تحضيراً قياسياً للعينات باستخدام أنسجة الساق وكواشف تحرير DNA لضمان اتساق جودة المدخلات.
- يتطلب عينات مرجعية من النوع البري (wild-type) لضمان التخصيص الدقيق للمجموعات ومعايرة ملف الصهر.
- يقتصر بضرورة إجراء تسلسل جيني بعد تحليل HRMA لتوصيف عمليات الحذف والإدراج (indels) بشكل كامل والكشف عن طفرات إضافية في التسلسل المستهدف.
الأسئلة الشائعة حول الأدوية الحيوية
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:33
A Gradient PCR Using Genomic DNA (gDNA) from a Single Individual
1:09
Preparation of Genomic DNA from Mosquito Legs
2:31
Perform PCR
3:35
Results: Detection of CRISPR/Cas9-Induced Indels and the Establishment of Mutant Lines in the Mosquito Aedes aegypti
5:02
Conclusion
