تشريح المقطع المبرد للمنطقة تحت البطانية للبالغين من أجل تحليل دقيق وعميق للبروتيوم الكمي

تسمح طريقة التشريح لدينا بالعزل الدقيق للمكانة العصبية البطينية ، وبالتالي فهي مناسبة تماما لدراسة البيئة الدقيقة الجزيئية لهذا المكان. الميزة الرئيسية لطريقة التشريح هذه هي أنها دقيقة وفعالة وتسبب الحد الأدنى من اضطراب الأنسجة بينما لا تزال متوافقة مع قياس الطيف الكتلي لتحليل البروتيوم. في هذا البروتوكول ، نستخرج المكانة العصبية للبطين من دماغ الفأر ، ولكن يمكن أيضا تطبيق هذه الطريقة على الأنواع الأخرى وفي مختلف حالات الصحة والمرض.

قد تتطلب هذه التقنية بعض التدريب. خاصة مع قطع المشرط عند تعريض واستخراج مكانة البطين العصبية. بعد القتل الرحيم لفأر أسود C57 / 6 من عمر 8 إلى 10 أسابيع ، قم باستخراج الدماغ عن طريق التشريح اليدوي ووضعه في طبق ثقافي يحتوي على وسط تشريح بارد مثلج.

باستخدام مشرط ، قم بإزالة المصباح الشمي عن طريق إجراء قطع إكليلي مستقيم بين المصباح الشمي والقطب الداخلي للقشرة. بعد ذلك ، قم بإزالة القطب الأمامي للقشرة عن طريق إجراء قطع إكليلي ، مما يضمن أن البطينين الجانبيين مرئيان في المستوى الإكليلي. ثم ، باستخدام المقص ، افتح كلا البطينين الجانبيين من الأعلى ، بدءا من القسم السهمي من السطح القشري إلى تجويف البطين.

قم بإطالة هذا القطع بطريقة على شكل حرف C بعد ثني البطين. بعد ذلك ، قم بتوصيل النهايات الذيلية للشق السهمي الأيسر والأيمن ، باستخدام قطع إكليلي إضافي. بعد ذلك ، قم بإزالة القشرة والجسم الثفني الذي يغطي جدران البطين الإنسي.

إذا كان النسيج متصلا بجدران البطين الإنسي ، فقم بإجراء جروح إضافية أو ارفع القشرة والجسم الثفني باستخدام مقص لإزاحة الأنسجة. ثم ، باستخدام الملقط ، قم بإزالة القشرة والجسم الثفني الذي يغطي البطينين الجانبيين. باستخدام الملقط ، انشر بعناية جدران البطين وقم بإزالة الضفيرة المشيمية.

ثم ضع الدماغ على شريحة زجاجية وضع الشريحة فوق الثلج الجاف لتجميد الدماغ مع جدران البطين في التكوين المفتوح. قبل التقسيم، تأكد من توصيل الدماغ بلوحة التعلق بالتبريد في الدماغ الخلفي مع وسيط تضمين للأنسجة المجمدة. بالإضافة إلى ذلك، تأكد من عدم ملامسة أي وسيط للتضمين للدماغ الأمامي، خاصة عند البطينين.

ثم ، قم بقطع أقسام إكليلية بسماكة 50 إلى 100 ميكرومتر من الدماغ حتى نهاية البطين الجانبي ، وقم بتركيب الأقسام على الشرائح الزجاجية. ضع الشرائح الزجاجية على الثلج الجاف تحت مجهر التشريح. ارفع الشرائح من الثلج الجاف لمدة 15 إلى 30 ثانية لتحقيق ذوبان قصير وغير مكتمل ، مما يجعل المايلين المضغوط للمخطط قابلا للملاحظة كنقاط بيضاء كثيفة.

ثم ، باستخدام مشرط مبرد مسبقا ، افصل المنطقة تحت البطانية عن المخطط المجاور ، وانقلها كقطعة كاملة أو مقطعة إلى قسمين إلى أربعة أجزاء في أنبوب طرد مركزي دقيق باستخدام الحافة الحادة للمشرط المبرد. ثم افعل الشيء نفسه بالنسبة لمنطقة البطين الإنسي. تم تحديد الكبسولات الداخلية المرتبطة بالمايلين وإيجابية البروتين السكري للمخطط في عينات الجبل الكامل ، ولكن نادرا ما تم تحديدها في عينات تشريح المقطع المبرد عن طريق الكيمياء النسيجية المناعية.

تم تأكيد التلوث المخططي في عينات الجبل الكامل عن طريق إثراء بروتينات المايلين في المنطقة تحت البطانية ، مقارنة بعينات القشرة الجسدية الحسية. وعلى النقيض من ذلك، أظهرت المقارنات بين بروتينات علامات المايلين هذه في عينات تشريح المقطع المبرد عدم وجود اختلافات كبيرة في المنطقة تحت البطينية وعينات القشرة الجسدية الحسية. عند مقارنة نتائج قياس الطيف الكتلي بين تشريح المقطع بالتبريد والتشريح المجهري لالتقاط الليزر، أسفر التشريح المجهري لالتقاط الليزر عن ما يقرب من نصف عدد البروتينات الكمية، على الرغم من أن وقت جمع الأنسجة كان حوالي ضعف المدة.

يكشف تحليل المكونات الرئيسية أن هناك تباينا أكبر بين العينات التي تم جمعها باستخدام التشريح المجهري لالتقاط الليزر ، والتي تم تصويرها على أنها مربعات ، مقارنة بالعينات التي تم جمعها باستخدام تشريح المقطع بالتبريد ، والتي تم تصويرها على شكل دوائر. كشف اختبار إثراء التعليق التوضيحي 2D بين تشريح المقطع المبرد والتشريح المجهري لالتقاط الليزر للمناطق تحت البطانية والإنسية عن إثراء مماثل في كل من الطرق والمناطق للبروتينات المرتبطة بالفضاء خارج الخلية. يوفر تشريح المقطع بالتبريد تحديدا أكثر قوة وقياسا كميا لتكوين الخلايا العصبية في بروتينات المصفوفة خارج الخلية المرتبطة بالمنطقة تحت البطانية.

وفي حالة التيناسين-سي، لم يظهر سوى تشريح المقطع المبرد إثراء في المنطقة تحت البطانية مقارنة بالمنطقة الإبندية الإنسية. تأكد من أن أقسام الدماغ على الشرائح لا تذوب تماما. بشكل عام ، من الجيد ممارسة الخطوات في إجراء التشريح للحصول على نتيجة متسقة.

يمكن أيضا استخدام طريقة التشريح مع طرق تحليل البروتين الأخرى التي يمكنها بسهولة اكتشاف البروتينات الوفيرة المنخفضة جدا ، مثل عوامل النمو والسيتوكينات. سمحت لنا طريقة التشريح المجهري هذه بتحديد منظم جديد لتكوين الخلايا العصبية ، ونعتقد أنها ستسمح للآخرين بتحديد المنظمين الآخرين لتكوين الخلايا العصبية في سياقات مختلفة.