جمع وتوسيع وتمايز نماذج الخلايا الظهارية الأنفية البشرية الأولية لتحديد تردد ضربات الأهداب

وصفنا مجموعة الخلايا الجذعية لمجرى الهواء من الغشاء المخاطي للأنف. يتم توسيع هذه الخلايا وتمييزها إلى ظهارة طبقية زائفة في المختبر. هذا هو التوسع والتمايز في المختبر ، والذي يشبه الشعب الهوائية لدينا في الجسم الحي ، مما يعني أن هناك خلايا متخصصة ، مثل الخلايا الهدبية ، موجودة يمكن استخدامها لقياس تردد ضربات الأهداب.

لتمكين القياس الكمي المتسق والقابل للتكرار لتردد ضربات الأهداب بين الأفراد المختلفين واستجابة للعقاقير المختلفة ، نقوم بتوحيد ظروف الثقافة واكتساب الصور. تستخدم قياسات تردد ضربات الأهداب كأدوات سريرية في مرض مثل خلل الحركة الهدبي الأولي. نأمل في إنشاء هذا كعلامة سريرية للتليف الكيسي.

يوضح الإجراء كاتيلين آلان ولورا فوسيت ، طلاب الدكتوراه من مختبري ، والدكتورة شارون وونغ ، باحثة ما بعد الدكتوراه من مختبري. ابدأ بمطالبة المشارك بالتنفس من خلال فمه. ثم أخذ فرشاة علم الخلايا في اليد المهيمنة وإراحة الرقم الخامس على ذقن المشارك لتثبيت اليد ، وأدخل فرشاة علم الخلايا في الممر الأنفي للمشارك بزاوية 45 درجة على وجه المشارك ، وقم بتمريرها عبر الصماخ الأنفي.

بعد تدوير الفرشاة في وضع مستقيم ، بحيث تكون عمودية على وجه المشارك ، قم بدفع الفرشاة برفق ، ولكن بحزم ، ضد الجدار الجانبي للأنف أسفل القرينات السفلية حتى تكون في منتصف الجزء الخلفي من القرينات السفلية. قم بتدوير الفرشاة 360 درجة حتى ثلاث مرات. ثم قم بإزالته برفق ، وعكس مناورة الإدخال ، بحيث لا يتم إزاحة الخلايا من الفرشاة.

ضع الفرشاة في أنبوب التجميع المحضر باستخدام وسائط جمع الخلايا الأنفية ، وضع أنبوب التجميع على الثلج. بعد الدوامة اللطيفة لإزاحة الخلايا من الفرشاة ، انقل أنبوب التجميع على الثلج مرة أخرى إلى خزانة السلامة البيولوجية. باستخدام ماصة مصلية ، انقل الوسائط من أنبوب التجميع إلى أنبوب جديد ، تاركا وراءه فرش علم الخلايا.

ثم الطرد المركزي العينة. بعد الطرد المركزي ، أعد تعليق حبيبات الخلية في ملليلتر واحد من وسائط خلية إعادة البرمجة الشرطية. ثم باستخدام ماصة مصلية سعة خمسة ملليلتر ، مرر الخلايا عبر غربال خلية يوضع فوق أنبوب سعة 50 ملليلتر في حركة دائرية.

للحصول على تعليق خلية واحدة ، اجمع التعليق من أسفل الأنبوب ، وقم بتمريره عبر الغربال عدة مرات. ثم تجاهل غربال الخلية. لزرع الخلايا الظهارية في مجرى الهواء على حشوات الدعم القابلة للنفاذ المعدة ، امزج الخلايا جيدا دون إنشاء فقاعات ، مما يضمن أنها متجانسة وفي حالة تعليق.

ثم أضف 150 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى الجانب القمي من إدخالات الدعم القابلة للنفاذ المعدة. للتمييز بين الخلايا الظهارية في مجرى الهواء في واجهة الهواء السائل ، قم بزراعتها في التمايز ، أو وسائط ALI لمدة يومين. ثم استنشاق الوسائط ، وإضافة 750 ميكرولتر من وسائط ALI فقط إلى المقصورة القاعدية لإنشاء واجهة هواء سائل.

لزرع الخلايا الظهارية في مجرى الهواء في قباب ECM ، أعد تعليق الخلايا الظهارية المنفصلة في مجرى الهواء بالحجم المناسب 90٪ ECM. ثم أمسك الماصة عموديا بزاوية 90 درجة بالقرب من قاع البئر قدر الإمكان ، وقم بتوزيع 50 ميكرولتر من تعليق خلية ECM إلى وسط البئر. احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة حتى تصلب ECM.

أثناء تصلب ECM ، قم بتسخين وسائط البذر العضوي في مجرى الهواء ، أو AOSM ، إلى درجة حرارة الغرفة لمنعها من التسبب في إعادة التسييل ، وتفكك قبة ECM عند الإضافة. بعد الحضانة ، أضف 500 ميكرولتر من AOSM الدافئ إلى كل بئر عن طريق الاستغناء عن جدار البئر. لا تقم بسحب وسائط الماصة مباشرة على قبة ECM.

قم بتغيير الوسائط كل يومين لمدة أربعة إلى سبعة أيام. لشفط الوسائط ، قم بإمالة اللوحة بزاوية 45 درجة وشفط من الحافة السفلية للبئر بعيدا عن قبة ECM. بعد أربعة إلى سبعة أيام ، ابدأ التمايز العضوي عن طريق إضافة 500 ميكرولتر من وسائط التمايز العضوي في مجرى الهواء الدافئ ، أو AODM ، إلى كل بئر ، وقم بتغيير الوسائط كل يومين لمدة سبعة أيام.

ضع صفيحة الاستزراع التي تحتوي على نماذج الخلايا الظهارية في مجرى الهواء في ملحق لوحة المجهر ، وأغلق الغرفة البيئية للمجهر. اسمح للعينة بالتوازن في غرفة المجهر المملوءة بثاني أكسيد الكربون مسبقا ، 37 درجة مئوية ، 5٪ لمدة 30 دقيقة. في عدسة المجهر ، ركز على نموذج الخلية.

ثم باستخدام برنامج الاستحواذ ، انقر فوق L100 لتبديل مسار الضوء إلى المنفذ حيث تم تركيب الكاميرا. انقر فوق الزر "تشغيل" الأخضر لتصور مجال رؤية المجهر عبر البرنامج. تأكد من أن الأهداب في بؤرة التركيز ، واضبطها إذا لزم الأمر.

للحصول على صور الفاصل الزمني من القائمة ، انقر فوق اكتساب ، ثم على Fast TimeLapse. في النافذة المنبثقة ، حدد موقع حفظ ، واسم الملف ، والحصول على 1،000 إطار. لمعاينة الأهداب في مجال رؤية المجهر ، انقر فوق تطبيق ، متبوعا بزر التشغيل الأخضر.

اضبط التركيز البؤري Z إذا لزم الأمر. ثم اضغط تشغيل الآن لالتقاط الفاصل الزمني السريع. بعد تثبيت البرامج وصناديق الأدوات الضرورية، انسخ البرامج النصية المخصصة المناسبة للتحليل ومجلد البرامج النصية للدعم إلى محرك الأقراص المحلي للكمبيوتر.

بعد ذلك ، في برنامج الحوسبة ، انقر فوق علامة التبويب الصفحة الرئيسية ، متبوعة بتعيين المسار. في النافذة المنبثقة ، انقر فوق إضافة مع المجلدات الفرعية. ضمن مسار بحث MATLAB ، حدد المجلد المعروض.

ثم انقر فوق حفظ وإغلاق. تأكد من أن البرامج النصية للتحليل مرتبطة ببرنامج الحوسبة عن طريق التحقق من ظهورها في اللوحة اليمنى. بعد ذلك ، انقل أمثلة ملفات الصور الأولية التي تم الحصول عليها إلى محرك الأقراص المحلي للكمبيوتر.

ثم انقر فوق BeatingCiliaBatchOMEfiles_jove. م تحليل ملف البرنامج النصي في برنامج الحوسبة. لتشغيل البرنامج النصي ، انقر فوق علامة التبويب محرر ، متبوعا بزر التشغيل الأخضر.

في نافذة المطالبة التي تظهر ، حدد ملفات الصور الأولية المراد تحليلها. أدخل وقت التعرض لوقت الاكتساب لكل إطار. ثم انقر فوق موافق. قم بتشغيل جيتفيرست أمبليتيود.

م البرنامج النصي على المجلد الذي يحتوي على ملفات AveSpectrum. انتظر حتى يقوم البرنامج النصي بإخراج فيرست أمبليتيوستاكيد. XLSX ، الذي يحتوي على أعلى تردد السعة ، وهو ضمن النطاق الفسيولوجي لضرب الأهداب الظهارية في مجرى الهواء.

انسخ قيم التردد من فيرست أمبليتيموديكسيد. XLSX ، ورسمها باستخدام برنامج التحليل العلمي. تم تقديم نتائج تردد ضربات الأهداب المقاسة في نماذج ALI للخلايا الظهارية في مجرى الهواء المشتقة من ثلاثة مشاركين مصابين بالتليف الكيسي وثلاثة مشاركين أصحاء في السيطرة.

في اليوم 14 من التمايز الثقافي ، كان ضرب الأهداب حاضرا. من اليوم 14 ، اليوم 21 من تمايز الثقافة ، لم تلاحظ زيادة ذات دلالة إحصائية في تواتر ضربات الأهداب بين الأفواج. في اليوم 21 من تمايز الثقافة ، كان متوسط تردد نبض الأهداب للمشاركين الأصحاء أعلى بكثير من المشاركين المصابين بالتليف الكيسي.

علاوة على ذلك ، عندما تم تصوير تردد نبض الأهداب في نفس نماذج الخلايا بعد إزالة المخاط ، كانت هناك زيادة ذات دلالة إحصائية في تردد نبض الأهداب عندما تمت إزالة المخاط في نماذج ALI لكل من الأفراد الأصحاء والمصابين بالتليف الكيسي. يجب تنظيم بيئة التصوير بشكل صارم ، لأن وظيفة الأهداب معرضة للغاية للتغيرات في العوامل البيئية. هذه المنصة لديها القدرة على إنشاء لفحص الأدوية الخاصة بالمريض لتكون قادرة على تحديد الأدوية التي تعدل وظيفة CFTR.