بروتوكول اقتصادي وفعال لعزل وزراعة الخلايا الشجيرية المشتقة من نخاع العظم من الفئران
يوليو 1, 2022
هنا ، نقدم طريقة اقتصادية وفعالة لعزل وتوليد خلايا تغصنية عالية النقاء مشتقة من نخاع العظام من الفئران بعد 7 أيام من الزراعة مع 10 نانوغرام / مل GM-CSF / IL-4.
بروتوكول اقتصادي وفعال لعزل وتوليد الخلايا المتغصنة المشتقة من نخاع العظم من الماوس. تمت الموافقة على الإجراءات التي تنطوي على مواضيع حيوانية من قبل لجنة أخلاقيات الحيوان التابعة لجامعة نانجينغ الطبية.One.Introduction. مع الزيادة في أبحاث مناعة الورم ، يزداد الطلب على خلايا DC تدريجيا.
ومع ذلك ، فإن DCs نادرة في جميع الأنسجة. الطريقة التقليدية للحث بشكل رئيسي على تمايز نخاع العظم إلى DCs معقدة ومكلفة. اثنان. عزل نخاع العظم وإعداد الخلايا BM نحن نضحي بالفئران ونصلحها على طاولة عمليات الفئران.
قطع جلد العضلات اليسرى المكشوفة والشريان الفخذي. لا تقطع الشريان الفخذي مباشرة. خلاف ذلك ، فإنه سوف يسبب نزيفا حادا ويلوث مجال الرؤية.
قطع جميع العضلات حول عظم الفخذ. تمتد ببطء الأطراف السفلية للفأر إلى الخارج حتى هبوط رأس الفخذ ويمكن ملاحظتها. افصل الأطراف السفلية عن الجسم.
قطع الساق الخلفية للحصول على عظم الفخذ الحرة والكاملة. إزالة العضلات باستخدام الشاش. لا تمزق العضلات مباشرة.
عظم الفخذ من الفئران هشة. ضع عظم الفخذ في 75٪ من الكحول لمدة دقيقتين إلى خمس دقائق. تلاتة. ثقافة الحقن من BMDC شطف الكحول المتبقي مع PBS.
المشبك الجزء الأوسط والسفلي من عظم الفخذ مع ملقط مرقئ ، والمشبك الطرف السفلي من عظم الفخذ مع ملقط مرقئ آخر. يتم تطبيق ملقط مرقئ حرفيا على عظم الفخذ ويتم كسر عظم الفخذ من خط المشاش. استخدم حقنة مل واحدة لاختراق تجويف نخاع العظم من خط المشاش.
استخدم جزأين متوسطين كاملين لغسل تجويف نخاع العظم حتى يصبح العظم أبيض. جمع سوائل التنظيف. تكملة الوسط الكامل الذي يحتوي على GM CSF / IL-4 إلى 24 مل ، والبذور في طبق من 6 آبار مع 4 مل لكل بئر. أربعة.النتائج.
بعد يومين، استبدل جميع الوسائط التي تحتوي على GM-CSF/IL-4. واستبدل نصفها الوسيط الكامل المحتوي على GM-CSF/IL-4، في اليوم الرابع والسادس والثامن. وصل عدد الخلايا إلى ذروته في اليوم السابع ثم انخفض تدريجيا.
شكلت خلايا DC عددا كبيرا من نقاط الاشتباك العصبي التي تظهر مورفولوجيا خلايا DC ناضجة نموذجية. تظهر تحليلات المقاييس الفرعية للتدفق أن نسبة CD11c فرضت ما 71٪ في اليوم السادس ، وزيادة النسبة الواسعة إلى 96.1٪ في اليوم العاشر. زاد التعبير عن CD11c و CD80 و MSC2 تدريجيا مع زيادة وقت الزراعة. خامسا.الاستنتاج.
باختصار ، أنشأنا بروتوكولا اقتصاديا وفعالا لعزل وتوليد الخلايا المتغصنة المشتقة من نخاع العظام من الفئران ، والتي تستغرق 10 دقائق فقط لفصل خلايا نخاع العظام. تم حصاد عدد كبير من DCs عالية النقاء بعد ستة إلى سبعة أيام من الثقافة مع 10ng لكل مل ، GM-CSF ، و IL-4.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة طريقة اقتصادية وفعالة لعزل وتوليد خلايا شجيرية عالية النقاء مشتقة من نخاع العظم للفئران. يتضمن البروتوكول استزراعاً لمدة 7 أيام باستخدام GM-CSF/IL-4.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- علم المناعة
- بيولوجيا الخلية
خلفية علمية
- تعد الخلايا التغصنية (DCs) ضرورية لأبحاث المناعة الورمية.
- تتواجد الخلايا التغصنية بنسبة ضئيلة في الأنسجة، مما يجعل عزلها أمراً صعباً.
- تتسم الطرق التقليدية لتمايز الخلايا التغصنية بالتعقيد والتكلفة العالية.
- تهدف هذه الدراسة إلى تبسيط عملية توليد الخلايا التغصنية من نخاع العظم.
الغرض من الدراسة
- تطوير طريقة فعالة من حيث التكلفة لعزل الخلايا التغصنية (DCs).
- تحسين كفاءة توليد الخلايا التغصنية (DCs) من نخاع عظم الفئران.
- دعم الأبحاث في مجال المناعة الورمية من خلال توفير خلايا تغصنية (DCs) عالية النقاوة.
الطرق المستخدمة
- عزل نخاع العظم من الفئران.
- زراعة خلايا نخاع العظم باستخدام GM-CSF/IL-4.
- تقييم نقاء الخلايا وحيويتها.
- الحصول على موافقة لجنة أخلاقيات التعامل مع الحيوان المؤسسية.
النتائج الرئيسية
- عزل ناجح للخلايا الشجرية المشتقة من نخاع العظم عالية النقاء.
- كفاءة مثبتة للبروتوكول الجديد.
- إمكانية التطبيق على نطاق أوسع في أبحاث المناعة الورمية.
- تقليل الوقت والتكلفة مقارنة بالطرق التقليدية.
الاستنتاجات
- تعد الطريقة المطورة بديلاً قابلاً للتطبيق لتوليد الخلايا الغصنية (DC).
- يمكن لهذا النهج أن يسهل المزيد من الأبحاث في علم المناعة.
- قد تستكشف الدراسات المستقبلية تطبيقات في سياقات علاجية متنوعة.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
يعالج هذا البروتوكول مشكلة نقص إمدادات الخلايا التغصنية في أبحاث المناعة والمناعة الورمية من خلال توفير طريقة اقتصادية وعالية الإنتاجية لعزل الخلايا التغصنية المشتقة من نخاع العظام في الفئران. فهي تتيح إنتاجاً قابلاً للتوسع للخلايا التغصنية المحددة ظاهرياً مع تقليل استهلاك الكواشف والوقت المستغرق في العمل اليدوي، مما يدعم التحقق من الأهداف في المراحل المبكرة والدراسات الميكانيكية في مسارات العلاج المناعي. كما يعزز هذا النهج من الثقة التنبؤية في النماذج قبل السريرية من خلال تقديم نظام قابل للتكرار ومرتبط بالمرض لتقييم التعديل المناعي.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: يتيح استقصاء وظيفة الخلايا الشجرية في مسارات تقديم المستضد وتنشيط الخلايا التائية.
- القيمة التشغيلية: يقلل من تكلفة وتعقيد توليد الخلايا الشجرية باستخدام تمايز قياسي بواسطة GM-CSF/IL-4.
- القيمة العلمية: يدعم التحقق الوظيفي من الأهداف من خلال التوصيف المظهري للتعبير عن CD11c و CD80 و MHC II بمرور الوقت.
الفحص وتطوير المقايسة
- القيمة العلمية: يُنتج مجموعات من الخلايا الشجرية عالية النقاء (80%-95% CD11c+) مناسبة للمقاييس المناعية الموحدة.
- القيمة التشغيلية: يوفر ما يصل إلى 2.7 x 107 خلية لكل فأر، مما يتيح تنسيقات الفرز عالية الإنتاجية.
- القيمة العلمية: يوفر نظاماً بيولوجياً متسقاً لتقييم تأثيرات المركبات على نضج الخلايا الشجرية والوظيفة المناعية.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- القيمة العلمية: يُنشئ نظاماً ذا صلة بالمرض لنمذجة استجابات الخلايا الغصنية في سياقات المناعة الورمية.
- القيمة التشغيلية: يدعم التقييم قبل السريري للعوامل المعدلة للمناعة مع مدخلات خلوية محددة.
- القيمة العلمية: يسهل تقليل المخاطر الميكانيكية من خلال ربط النمط الظاهري للخلايا الغصنية بالنتائج الوظيفية في أنظمة الزراعة المشتركة.
تكامل خطوط المعالجة وسير العمل
تندرج هذه الطريقة ضمن سلسلة الاكتشاف التي تمتد من التحقق من الهدف عبر تحديد المركبات الرائدة وصولاً إلى التقييم قبل السريري، مما يوفر مصدراً متجدداً للخلايا الشجيرية من أجل المقاييس التي تركز على المناعة.
- بيولوجيا الاكتشاف: يدعم اختبار الفرضيات المتعلقة بالمسارات المناعية المعتمدة على الخلايا الشجرية وارتباط الأهداف.
- الفحص: يقدم مخرجات خلوية كمية وقابلة للتكرار لتقييم النشاط المعدل للمناعة.
- التحليلات: يتيح قياس CD11c وCD80 وMHC II باستخدام قياس التدفق الخلوي كمؤشرات للنضج.
- البحث الانتقالي: يربط بين توليد الخلايا الشجرية في المختبر والنماذج قبل السريرية للتنشيط المناعي والتحمل.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: يؤسس لبروتوكول قياسي وقابل للتوسع لإنتاج الخلايا الشجرية عبر مشاريع علم المناعة المختلفة.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: زيادة الثقة التنبؤية في التحقق من الهدف من خلال مدخلات الخلايا التغصنية المحددة ظاهرياً.
- القيمة التشغيلية: تقليل الوقت والتكلفة عبر حصاد نخاع العظم في 10 دقائق واستخدام جرعات منخفضة من السيتوكينات (10 ng/mL GM-CSF/IL-4).
- القيمة الاستراتيجية: تحسين قرارات المضي قدماً أو التوقف من خلال توفير نماذج موثوقة للخلايا التغصنية لفحص العلاج المناعي.
- تأثير المحفظة: تمكين تحديد الأولويات المعدلة حسب المخاطر للمرشحات المعدلة للمناعة باستخدام خلايا مؤثرة مناعية معيارية.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في عزل نخاع العظم الفأري وتقنيات زراعة الخلايا المعقمة.
- يعتمد على توفر أطباق ذات 6 آبار، وملاقط تحليل الدم، والتدفق الخلوي للتحقق من النمط الظاهري.
- يستلزم توحيد تركيز السيتوكين وجدول تغيير الوسط الزرعي بين المستخدمين.
- يتضمن اعتبارات التكيف عند النقل إلى سلالات فئران أخرى أو خلفيات جينية مختلفة.
- يتقيد بنافذة زراعة تتراوح بين 7–10 أيام وما يصاحب ذلك من انخفاض في حيوية الخلايا بعد بلوغ الذروة.
