عزل الخلايا البطانية عن تجويف الشرايين السباتية للفئران لإجراء تجارب متعددة الخلايا أحادية الخلية
أكتوبر 4, 2021
نقدم طريقة لعزل الخلايا البطانية والنوى عن تجويف الشرايين السباتية للفئران المعرضة لظروف تدفق مستقرة أو مضطربة لإجراء تجارب omics أحادية الخلية.
في الأوعية الدموية ، يكون عدد الخلايا البطانية منخفضا جدا ، مما يجعل من الصعب دراستها. بروتوكولنا يلغي هذا القيد ، ويسمح لنا بدراسة المسارات الجزيئية والعلاجات الجديدة. يسمح لنا بروتوكولنا بالحصول على عينات مخصبة بطانية ، ودراسة كيفية تأثير التدفق المضطرب الحاد والمزمن على هذا النوع من الخلايا.
إن القدرة على دراسة الخلايا البطانية بمزيد من التفصيل تجعل من الممكن تحديد الجينات المستهدفة ، وبالتالي العلاجات المحتملة لتصلب الشرايين التي تستهدف الخلايا البطانية. عزل الشريان السباتي أمر صعب ، ويتطلب الصبر والخبرة. للبدء ، قم بإعداد الحيوان عن طريق حقن 0.05 ملليغرام لكل كيلوغرام من البوبرينورفين تحت الجلد.
تعقيم المنطقة المزيلة باستخدام محلول بيتادين والأيزوبروبانول ثلاث مرات. قم بعمل شق خط الوسط البطني يبلغ حوالي سنتيمتر واحد في منطقة الرقبة. ثم فضح نقطة فرع LCA عن طريق تشريح حاد.
قم بربط الشرايين السباتية الداخلية اليسرى والسباتية الخارجية والقذالي بخيوط 6-0 ، تاركا الشريان الدرقي العلوي دون مساس. أغلق الشق باستخدام غراء الأنسجة أو الغرز. انقل الماوس إلى قفص استرداد تم تسخينه مسبقا عند 37 درجة مئوية.
ضع الماوس على منشفة نظيفة لمدة تصل إلى ساعة واحدة لتجنب انخفاض حرارة الجسم بعد الجراحة. أدخل إبرة قياس 21 في الخط الوريدي المتصل عبر قمة القلب إلى البطين الأيسر. اسمح بالتروية الرجعية لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق باستخدام محلول ملحي عادي في درجة حرارة الغرفة.
حافظ على معدل تدفق ثابت من خلال تطبيق ضغط ثابت أثناء الحقن أو استخدام خط IV ، والحفاظ على الكيس الملحي على ارتفاع ثمانية إلى تسعة أقدام. إزالة الجلد من منطقة الرقبة مع جميع الدهون والعضلات والأنسجة الضامة لفضح الشرايين السباتية. ثم قم بإزالة الأنسجة المحيطة بالقناة حول السباتيدات تاركا السباتي متصلا بالجسم.
قم بعمل شق أسفل موقع الربط في LCA للسماح بالتروية. قم بدمج LCA من خلال البطين الأيسر لمدة دقيقة أخرى لإزالة أي آثار دموية. اغسل الجزء الخارجي من الشرايين السباتية بمحلول ملحي طبيعي لإزالة أي آثار للدم.
استخدم حقنة الأنسولين مع إبرة قياس 29 لحقن 50 ميكرولتر من مخزن الهضم العازل في تجويف الطرف البعيد من الشريان السباتي الأيسر. استخدم مشبكا صغيرا لتثبيت الطرف القريب من الشريان السباتي المليء بمخزن الهضم. أضف 15 إلى 20 ميكرولترا من المخزن المؤقت للهضم إلى التجويف ، وقم بقص الطرف البعيد لتجنب أي إطلاق للمخزن المؤقت للهضم.
انقل الشرايين السباتية من الفأر إلى أطباق 35 ملم تحتوي على محلول ملحي دافئ 37 درجة مئوية HEPES. واحتضنها لمدة 45 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع هزاز متقطع. قم بإزالة الشريان السباتي باستخدام المشابك من طبق 35 ملم بعد اكتمال الهضم الأنزيمي المضيء.
افصل المشابك بعناية ، بحيث لا يتسرب المخزن المؤقت للهضم. امسك أحد طرفي الشريان السباتي فوق أنبوب طرد مركزي صغير سعة 1.5 ملليلتر. أضف 100 ميكرولتر من مخزن الهضم الدافئ إلى التجويف عن طريق إدخال إبرة قياس 29 مجهزة بحقنة أنسولين.
اغسل تجويف الشريان السباتي بسرعة في أنبوب الطرد المركزي الدقيق، ثم أضف 0.3 ميكرولتر من FBS إلى الأنبوب لوقف التفاعل. ضع أنبوب الطرد المركزي الصغير على الجليد. قم بطرد الخلايا مركزيا عند 500 G لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية ، باستخدام جهاز طرد مركزي مجهز بدوار ثابت الزاوية وتخلص من السوبرنات.
أعد تعليق الخلايا في مخزن الهضم العازل ، الذي يحتوي على كاشف تفكك الخلايا ، واحتضنها لمدة خمس دقائق عند 37 درجة مئوية لفصلها إلى خلايا مفردة. منع التفاعل الإنزيمي عن طريق إضافة 0.15 ملليلتر من FBS إلى أنبوب 0.5 ملليلتر، وتكرار الطرد المركزي. تخلص من السوبرناتانت ، وأعد تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من محلول 1٪ BSA البارد في PBS في أنبوب طرد مركزي صغير 0.2 ملليلتر.
لتحليل خلية واحدة ، أعد تعليق الكريات مع 100 ميكرولتر من الثلج البارد 1٪ BSA في PBS في أنبوب 0.2 ملليلتر. لتحليل النواة المفردة ، أعد تعليق حبيبة الخلية في 100 ميكرولتر من 0.04٪ BSA في PBS البارد الجليدي ، وقم بالطرد المركزي لتعليق الخلية الواحدة عند 500G عند أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. تحلل تعليق الخلية الواحدة باستخدام مخزن مؤقت للتحلل البارد المثلج ، واحتضنه لمدة خمس دقائق على الجليد.
امزج الليزات مع ماصة P20 ، واحتضنها لمدة 10 دقائق أخرى. بعد ذلك ، انقل الليزات في أنبوب 0.5 ملليلتر. اغسل الخلايا ب 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت ، واخلطها باستخدام ماصة.
ثم كرر الطرد المركزي. تخلص من السوبرناتانت ، وأعد تعليق حبيبات النوى في 150 ميكرولتر من المخزن المؤقت للنوى المخففة. عد مستحضرات النوى المفردة باستخدام مقياس الدم.
بعد دراسة تسلسل النوى المفردة ، تم الحصول على خلية واحدة ونوى واحدة وتصورها بواسطة مجهر المجال الساطع وتباين الطور. كما تم إثبات كفاءة إعداد النوى المفردة من تعليق الخلية الواحدة. بعد دراسة تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية ، تم الحصول على معلمات مختلفة مثل توزيع الجينات لكل خلية ، والمعرف الجزيئي الفريد لكل خلية ، وقراءات الميتوكوندريا لكل خلية ، وبيانات تشبع التسلسل.
بالنسبة لدراسة تسلسل ATAC أحادية الخلية ، لوحظ توزيع حجم الإدراج ، بما في ذلك نمط النطاقات النيوكليوسومية. كما لوحظت درجة التخصيب TSS العادية. بالإضافة إلى ذلك ، يقرأ الجزء المئوي في القمم.
تم تحديد شظايا منطقة الذروة ، ودرجة إثراء TSS ، ونسبة القراءات في مواقع الجينوم في القائمة السوداء ، ونسبة إشارة النيوكليوسومات. الهضم الأنزيمي هو إجهاد للخلايا ، لذلك من الأهمية بمكان الحفاظ على العينات على الجليد ، وتنفيذ الإجراء في أسرع وقت ممكن. يمكننا استخدام هذه الطريقة للحصول على الخلايا البطانية ولوحتها من الفئران.
يمكننا أيضا استخدام هذه التقنية لإجراء دراسات قائمة على Omix بالجملة. مهدت هذه التقنية الطريق لدراسة تأثير تدفق الدم المضطرب على الخلايا البطانية في الجسم الحي بطريقة خلية واحدة.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تقدم هذه الدراسة بروتوكولًا جديدًا لعزِل الخلايا البطانية والنوى من شرايين الرقبة الفئران تحت ظروف تدفق مختلفة، مما يُمكِّن من فحص مُفَصَّل للمسالك الجزيئية المتعلقة بتصلُّب الشرايين. تعمل هذه الطريقة على تعزيز القدرة على إجراء تجارب علمية خلوية مفردة، مما يسهل دراسة استجابات الخلايا البطانية لتدفق الدم المضطرب.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال البحث
- علميات خلوية مفردة
- بيولوجيا الخلايا البطانية
- بحوث تصلُّب الشرايين
الخلفية
- يصعب دراسة الخلايا البطانية بسبب ندرة وجودها في الأوعية الدموية.
- يُحسِّن البروتوكول بشكل كبير من غلة العينات الغنية بالخلايا البطانية.
- فهم المسالك الجزيئية المتأثرة بديناميات تدفق الدم أمر بالغ الأهمية للتطوير العلاجي.
الطرق المستخدمة
- عزِل الخلايا البطانية والنوى من شرايين الرقبة للفئران.
- التجربة في الجسم الحي مع ظروف تدفق مختلفة.
- استخدام الهضم الأنزيمي وتقنيات معالجة الخلايا اللاحقة.
النتائج الرئيسية
- استخراج وتحليل ناجح للخلايا البطانية المفردة لنمذجة التعبير الجيني.
- تحديد الاستجابات لكل من ظروف التدفق المضطرب الحادة والمزمنة.
- تأسيس أهداف علاجية محتملة لتصلُّب الشرايين.
الاستنتاجات
- تبرهن هذه الطريقة على مقاربة قوية لدراسة الخلايا البطانية في سياق خلية مفردة.
- النتائج لها آثار مهمة في فهم بيولوجيا الأوعية الدموية وتطوير علاجات للأمراض الوعائية.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Isolation of endothelial cells from mouse carotid arteries enables high-resolution single-cell multi-omics profiling of vascular responses to disturbed blood flow. This approach addresses a critical bottleneck in target validation for atherosclerosis by enriching rare endothelial populations for transcriptomic and epigenomic analysis. The method supports predictive confidence in early discovery and informs risk-adjusted portfolio decisions for vascular disease programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of endothelial-specific gene regulation under physiologically relevant flow conditions.
- Supports mechanistic de-risking by clarifying pathways driving proatherogenic responses.
- Facilitates functional target validation in knockout and transgenic mouse models.
- Improves predictive confidence for prioritizing vascular targets in discovery pipelines.
Screening & Assay Development
- Provides EC-enriched single-cell suspensions suitable for downstream omics workflows.
- Enables quantitative assessment of gene expression and chromatin accessibility at single-cell resolution.
- Supports assay reproducibility and standardization by minimizing contamination from non-endothelial cells.
- Prepares validated biological systems for scalable screening of candidate modulators.
Translational & Preclinical Research
- Aligns single-cell omics outputs with disease-relevant vascular phenotypes.
- Enables continuity from mechanistic discovery to preclinical validation in mouse and human artery explants.
- Supports translational biomarker identification for vascular inflammation and atherosclerosis.
- De-risks advancement decisions by providing high-content molecular readouts.
Pipeline & Workflow Integration
This EC isolation method integrates into the discovery continuum from early mechanistic studies to preclinical model validation, supporting both target identification and translational research.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of flow-regulated gene networks in endothelial cells.
- Screening: Delivers reproducible, EC-enriched preparations for quantitative omics assays.
- Analytics: Provides single-cell and single-nucleus sequencing outputs for robust comparative analysis.
- Translational Research: Facilitates adaptation to human artery explants for cross-species validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for vascular single-cell omics across diverse genetic backgrounds.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in vascular target validation.
- Operational Value: Standardizes EC isolation for reproducible, scalable single-cell workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency in vascular disease portfolios.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets and models for atherosclerosis research.
Implementation Considerations
- Requires technical expertise in microdissection and enzymatic digestion of small vessels.
- Needs access to high-throughput single-cell sequencing and bioinformatics infrastructure.
- Demands rigorous cross-team standardization to ensure reproducibility and data quality.
- Adaptation to human tissues may require protocol optimization for tissue size and composition.
- Cell stress from enzymatic digestion necessitates rapid processing and cold-chain management.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:51
Partial Carotid Ligation (PCL) Surgery
1:57
Isolation of Carotid Arteries Post Sacrifice
3:02
Endothelial-Cell-Enriched Single-Cell Isolation from Mice Carotids
4:02
Flushing the Carotid Arteries
5:53
Single-Cell and Single-Nucleus Analyses
7:18
Results: Standard QC Metrics for the scRNAseq and scATACseq Study
8:34
Conclusion
